[发明专利]基于RNA靶标SAT淋病奈瑟菌感染分子生物学检测方法

说明书

本发明提供了一种基于RNA靶标的SAT的淋病奈瑟菌感染分子生物学检测方法，包括如下步骤：步骤一，采用特异性靶标捕获技术，磁珠法提取纯净的细胞靶核酸，即RNA作为靶标，包括：(1‑1)手工提取靶标核酸特异性；(1‑2)纯净的细胞靶核酸，即RNA作为靶标；步骤二，采用RNA实时荧光恒温扩增检测技术得到沙眼衣原体感染的检测结果，包括：(2‑1)M‑MLV反转录酶产生靶标核酸RNA的一个DNA拷贝；(2‑2)T7RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝；(2‑3)将带有荧光标记的优化探针和提取的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光信号由检测仪器捕获，根据信号的出现时间和强度得到沙眼衣原体感染的检测结果；步骤三，结合阳性对照和阴性对照对所述检测结果进行判定。

技术领域

本发明涉及一种细菌感染的分子生物学检测和鉴定技术领域，尤其涉及淋病奈瑟菌感染的分子生物学检测和鉴定的方法。

背景技术

淋病是由淋病奈瑟菌引起的感染，是性传播疾病的主要病种之一，其潜伏期短，传染性强，最常见的是有症状的泌尿生殖系统的感染，如尿道炎，宫颈炎，附睾炎，前列腺炎，输卵管炎等，如不及时治疗，淋球菌可侵犯眼睛，咽部，皮肤，直肠，盆腔等部位，甚至可经血流传播到其他部位，形成淋球菌性关节炎，腱鞘炎，脑膜炎，败血症等等。另一方面，有5％-20％的男性和60％的女性病人呈现无症状感染。

目前，淋球菌的实验室检测方法有：涂片检测，初步诊断；淋球菌培养；抗原检测法；核酸检测法等。传统的检测方法包括涂片，培养和免疫法等普遍存在检出率低，周期长，特异性差等缺点，给临床诊断带来困难。

分子生物学方法现有技术通常采用的是实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT)，该技术是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术。与传统的检测方法相比具有高灵敏度、高特异性、低污染和反应稳定。

关于国外病原体的检测技术，欧美疾控部门和WHO都推荐，分子诊断法作为CT检测的一种手段，是目前最为灵敏准确的方法。而且，只有分子诊断法可以检测尿液，因为采样方便，非常适用于CT的普遍筛查。在美国，恒温扩增技术(TMA)以64％的绝对优势成为主流的检测技术。国外研究表明，该技术不受标本取材的影响，取样方便，灵敏度高，特异性好，同时还可以用于用药情况的监测和判愈。对于医院而言，可提高其整体的诊疗水平，对病人而言，则避免了反复就诊，可降低诊治成本。国外市场是Gen-Probe公司的转录介导的扩增(TMA)，扩增并检测CT的rRNA。优点是每个感染细胞中有大量的rRNA，而且操作步骤简便，只是一个恒温过程，不需要变换温度的扩增仪。由于检测方法是终点检测，容易导致环境污染，国内尚无采用该法进行检测的报道。目前国内对性病CT的检测主要为胶体金和PCR。但培养的不易，胶体金检测结果的不佳，PCR的污染问题，也引发了临床对RNA检测的期盼。医院常规CT样本为尿道拭子和宫颈拭子(部分为阴道拭子)，需要专业的医务人员进行样本采集，对男性患者而言，采集样本过程痛苦。CT-SAT恒温扩增检测试剂盒是唯一获得SFDA批准的，可用于检测尿液样本的诊断试剂，灵敏度高，特异性好，并因扩增产物为RNA，可避免DNA引起的临床污染，然而其采样仍然属于侵入型，患者比较痛苦。

分子生物学方法RNA检测技术与传统的检测方法相比具有较高的灵敏度和特异性。RNA检测技术不仅可以检测尿道和宫颈拭子，而且可以检测尿液标本。以培养法为金标准，以PCR法为扩大金标准采用SAT检测男女生殖道标本的NG，拭子标本的灵敏度100％，特异性97.3％、准确度97.5％；首次排空尿液样本的灵敏度83.3％、特异性97.7％、准确度96.0％。尿液标本的选择，可减轻患者痛苦，减少医务人员工作量。由于RNA核酸检测技术的高灵敏度和特异性，在具备分子生物学条件的实验室，可以采用该方法常规检测应用，但是如何提取纯净的RNA靶标是目前的一大难题。

将现有技术的检测方法进行一个比较，参见表1，可以发现现有技术检测方法的明显的缺陷在于：操作较复杂，需有一定经验才能做好检测，且耗时长、手工操作，较复杂。