[发明专利]基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法

权利要求书

1.一种基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步，采用以下方法中的三种组合：

方法一、竞争法测定一种或两种重组人蛋白；

方法二、夹心法测定一种或两种重组人蛋白；

方法三、夹心法测定两种重组人蛋白融合蛋白的结合体；

第二步，设置荧光波长，读取荧光值，所述设置荧光波长具体为：Excitation 313nm,Emission 665nm/620nm, cutoff 630nm/590nm；

第三步，数据处理：根据荧光的比值与标准品的浓度进行四参数拟合，得到标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的浓度，所述荧光的比值为(Em665/Em620)×10⁴荧光的比值；

第四步，样品排序：采用坐标系将方法组合中每一个方法的检测值分别赋为样品X, Y以及Z轴坐标，得出样品在坐标系中位置；根据经验或实验结果，划定可接受标准区间，凡落入这个区间的样品，皆符合活性评价或筛选要求，所述每一个方法的检测值为浓度或荧光的比值，

其中第一步中的方法一具体为：

1）在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；

2）加入目标蛋白或其tag偶联信号受体；

3）加入铕穴状物偶联的抗目标蛋白或其tag的抗体；

4）以单独表达纯化的目标重组人蛋白或含相同tag的其他重组蛋白作为标准品；

5）在室温孵育2小时以上，在适合波长的激发光下读板，

第一步中的方法二具体为：

1）在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；

2）加入铕穴状物偶联的抗重组人蛋白或其tag的抗体，为荧光供体；

3）加入荧光信号受体偶联的抗重组人蛋白或其tag的抗体作为荧光受体；

4）在室温孵育2小时以上，在适合波长的激发光下读板，

在方法二的步骤3）和步骤4）之间增加如下步骤：以单独表达纯化的目标重组人蛋白或含相同tag的其他重组蛋白为标准品，

第一步中的方法三具体为：

1）在384微孔板中加入细胞上清液或待测物；

2）加入铕穴状物偶联的抗重组人蛋白或其tag的抗体，作为荧光供体；

3）加入荧光信号受体偶联的抗另一重组人蛋白或其tag抗体，作为荧光受体；

4）在室温孵育2小时以上，在适合波长的激发光下读板，

在方法三的步骤3）和步骤4）之间增加如下步骤：以单独纯化的两种重组人蛋白的混合物为标准品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，方法一的步骤5）中在室温孵育过夜。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，方法二的步骤4）中在室温孵育过夜。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，方法三的步骤4）中在室温孵育过夜。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第三步中，当荧光团供体或荧光团受体与重组人蛋白直接或间接结合后，有两个发射光620nm和665nm；(Em665/Em620)×10⁴ 荧光的比值经过产品特异性优化后与标准品的浓度成线性关系；如标准品不可得或线性关系难以优化，获得的(Em665/Em620)×10⁴荧光的比值，只要与实际产品浓度有相关性，亦能直接用于样品的排序。