[发明专利]基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法

说明书

本发明公开了一种基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白生物学活性与滴度检测方法，包括如下步骤：一，采用以下方法中的任意两种或三种：方法一、竞争法测定一种或两种重组人蛋白；方法二、夹心法测定一种或两种重组人蛋白；方法三、夹心法测定两种重组人蛋白融合蛋白结合体；二，设置荧光波长，读取荧光值；三，数据处理：根据荧光的比值与标准品的浓度得到标准曲线，计算样品浓度；四，样品排序：将上述方法的检测值赋为样品X,Y及Z轴坐标，得样品在坐标系中位置；划定可接受标准区间，落入该区间样品皆符合要求。本发明可系统、高通量地评价共表达产生的重组人蛋白各组分的活性/滴度，以支持生产细胞株克隆筛选和纯化工艺优化。

技术领域

本发明涉及均质性时间分辨荧光技术(荧光)，尤其涉及一种基于多个时间分辨荧光技术连用的共表达重组人蛋白的生物学活性与滴度检测的方法，用于细胞克隆筛选与纯化工艺的评价。

背景技术

均质性时间分辨荧光技术(Homogeneous Time Resolved Fluorescence,荧光)能够对荧光共振能量转移进行时间延迟测量，从而能够用于均质化样品的定量检测(参考文献1：Bazin H,Trinquet E,Mathis G.Time resolved amplification of cryptateemission:a versatile technology to trace biomolecular interactions.JBiotechnol.2002；82(3):233–50.)。该技术结合了荧光共振能量转移(FRET)和时间分辨荧光(TRF)两种技术。FRET技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为(能量)供体和(能量)受体，将供体和受体分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将受体和供体拉到足够近的距离，产生能量转移。受体受到激发，发出特定波长的发射光。由于受体分子的发射光来自于能量转移，所以在实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。如果与供体和受体结合的生物分子不存在相互作用，供体和受体距离较远，不能产生能量转移。时间延迟的检测方式，是通过时间分辨荧光(TRF)技术实现的，将背景荧光去除，提高了灵敏度。

现阶段，生物制药与生物工艺行业的产品主流是使用哺乳动物工程细胞株表达生产单抗或融合蛋白。均质性时间分辨荧光技术已可代替ELISA法广泛应用在筛选高产细胞株，原理主要是利用单抗或融合蛋白的Fc端来进行检测筛选(参考文献2：Idusogie EE,Castro JM,Casipit C,Sato A,Terasawa Y,Mulkerrin MG.Development of an antibodyscreening assay for selection of production cell lines.BioProcess Int.2008；6(4):20–33.)。随着生物制药目标蛋白和生产工艺复杂化，出现了在一株哺乳动物工程细胞株内同时表达两种重组人蛋白，直接形成聚合体的生产方式(共表达)。共表达产生的细胞上清液和初步纯化产品，成分较复杂，可能含有两种游离蛋白，以及不同比例结合的聚合体，且其中一个蛋白可能不含有Fc端。目前单一的荧光或者ELISA方法无法在克隆筛选以及工艺优化过程中提供全面比较各种组分含量的结果；组合使用针对不同重组人蛋白的荧光检测，也缺乏能够系统性将多个检测结果综合分析的平台方法。

中国发明专利申请(专利申请号：CN 201611230229X)公开了一种时间分辨荧光定量检测尿微量白蛋白的试剂盒及方法，该申请与本发明相比，只检测单一蛋白，而不是共表达蛋白结合体；只能检测白蛋白，检测蛋白品种不同；检测蛋白所在基质为尿液，与本发明的细胞上清和蛋白生产过程基质不同。

共表达重组人蛋白的生产过程中需要一个创新的检测方法体系，可以系统地、高通量地评价共表达产生的细胞上清液和初步纯化产品中的重组人蛋白结合体的的活性/滴度以及各组分分别的活性/滴度，以此来支持生产细胞株克隆筛选和纯化工艺优化。

发明内容