[发明专利]乳汁中表达GP5-M蛋白的奶山羊乳腺生物反应器的制备方法

权利要求书

1.乳汁中表达GP5-M融合蛋白的奶山羊乳腺生物反应器的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)构建基因打靶载体pBT-GP5-M

a、参照GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV美洲型代表株VR2332的GP5和M蛋白基因序列，设计并合成引物；

用RT-PCR方法分别扩增出PRRSV野毒株GP5和M蛋白基因片段，利用GP linker将两个基因连接起来，同时添加his标签和BGHpA组成GP5-M基因；

b、以克隆山羊β乳球蛋白基因CDS区上游810bp同源序列SEQ ID NO:10和下游715bp同源序列SEQ ID NO:11，分别作为5’端和3’端同源臂，构建基因打靶载体pBT-GP5-M；

(2)打靶载体pBT-GP5-M转染山羊胎儿成纤维细胞

将1-3代的山羊胎儿成纤维细胞，培养至细胞达到80％汇合时，将打靶载体pBT-GP5-M和TALEN载体共同导入山羊胎儿成纤维细胞，筛选出中靶细胞进行接种并扩大培养；

(3)中靶细胞的PCR鉴定

对中靶细胞进行PCR鉴定，确认中靶细胞克隆；对中靶细胞克隆进行染色体分析，将染色体数正常比例大于70％的中靶细胞克隆用于核移植，制备转基因奶山羊；

(4)转GP5-M基因克隆奶山羊的制备

将步骤(3)得到的所述中靶细胞100％汇合后，核移植到去核后的卵母细胞中；放入融合液，再进行融合形成重组胚胎；将所述重组胚胎植入同步发情的受体羊输卵管中，得到转基因克隆羊；

(5)转基因克隆奶山羊的检测

提取出生小羊血液基因组DNA，进行PCR检测，结果表达打靶载体正确插入山羊β-乳球蛋白基因座第一外显子上，且读码框正确。

2.根据权利要求1所述的乳汁中表达GP5-M蛋白的奶山羊乳腺生物反应器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述引物如下：

GP5基因扩增引物：

Forward：TGTATCGTGCCGTTCTATCTTG；SEQ ID NO:1

Reverse：GCAGTTCTTCGCAAGCCTAAT；SEQ ID NO:2

M基因扩增引物：

Forward：TCGGGTACATGACATTCGTGC；SEQ ID NO:3

Reverse：TGCCGCAATCGGATGAAA；SEQ ID NO:4。

3.根据权利要求1所述的乳汁中表达GP5-M蛋白的奶山羊乳腺生物反应器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述PCR鉴定的引物如下：

5’junction鉴定引物：

Forward：TAGCAACGCCCAAGTGGATTC；SEQ ID NO:5；

Reverse：AAGCAACTGGCTGGTGGTGAG；SEQ ID NO:6；

3’junction鉴定引物

Forward：CCACCAAGCGAAACATCG；SEQ ID NO:7；

Reverse：TGACCACACACAGGCACC；SEQ ID NO:8。

4.根据权利要求1所述的乳汁中表达GP5-M蛋白的奶山羊乳腺生物反应器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述基因打靶载体pBT-GP5-M包括包含目的基因、his标签、GP5基因序列、GP linker、M基因序列、BGH pA，两个loxP序列和neo基因。

5.根据权利要求1所述的乳汁中表达GP5-M融合蛋白的奶山羊乳腺生物反应器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中打靶载体pBT-GP5-M和TALEN载体共同导入山羊胎儿成纤维细胞的方法为电穿孔技术。

6.根据权利要求1所述的乳汁中表达GP5-M融合蛋白的奶山羊乳腺生物反应器的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述融合液的组成为0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸和0.1％BSA。