[发明专利]乳汁中表达GP5-M蛋白的奶山羊乳腺生物反应器的制备方法

说明书

本发明公开了乳汁中表达GP5‑M融合蛋白的羊乳腺生物反应器的制备方法，制备GP5‑M融合表达的基因打靶载体，敲入奶山羊β‑乳球蛋白第一外显子上，筛选中靶细胞，利用体细胞核移植技术制备转基因奶山羊，通过乳腺生物反应器生产含有GP5‑M融合蛋白的乳汁，从乳汁中分离纯化GP5‑M融合蛋白，添加佐剂制备基因工程亚单位疫苗，达到防控PRRS的目的。

技术领域

本发明涉及动物基因工程技术领域，特别是涉及乳汁中表达GP5-M融合蛋白的羊乳腺生物反应器的制备方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗称为猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高度接触性的传染病，临床上表现为母猪晚期流产、早产、死胎和木乃伊胎等繁殖障碍，仔猪严重的呼吸道症状，死亡率高。该病在全世界大范围流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。根据核苷酸序列差异，病毒可分欧洲和美洲两个基因型。我国分离的一系列PRRSV毒株大多是美洲型，对我国造成巨大经济损失，2008年该病被列为一类动物疫病。

疫苗接种是防治该病的主要手段。目前，已经获得批准上市的PRRSV疫苗包括灭活疫苗和弱毒疫苗。PRRS弱毒疫苗具有多种优势，包括诱导的免疫力强、保护期长、抗体产生速度快，而且母猪免疫接种可以使幼仔猪获得被动免疫。当前广泛使用的弱毒疫苗主要有PRRSATP(Boehringer Ingelheim)、PRRS MLV、PRRS CH-1R株弱毒苗、Porcilis PRRS V(Netherland)、PrimePacPRRS(Schering-Plough)，以及HP-PPRS V变异株HuN4弱毒苗等。虽然PRRS弱毒疫苗有很多优点，但是在安全性方面存在一定的问题。研究发现，在接种弱毒疫苗后，导致母猪繁殖性能障碍，有的出现死胎和木乃伊胎，还可能造成疫苗毒的传播，引起PRRSV的持续感染，出现典型的PRRS症状。因此，人们在使用弱毒疫苗时极为慎重。在未发生PRRS的猪场中避免使用弱毒疫苗，不用弱毒疫苗免疫种猪，在欧洲一些国家禁止用弱毒疫苗。灭活疫苗在防治PRRS中最早应用的疫苗，有多株商品化的安全的PRRS灭活苗，其灭活疫苗的使用不存在安全性问题，便于贮存和运输。目前常使用的灭活苗有加拿大的北美洲型PRRSV(IAF-klop)灭活苗，法国的欧洲型PRRSV灭活苗，德国PRRomiSe及我国的CH-la株灭活苗。用PRRS灭活疫苗免疫猪后，可刺激猪体产生特异性抗体，起到免疫保护作用。但是灭活苗也存在一些缺点，灭活过程中可能破坏抗原表位，一次免疫不能产生足够的免疫效力，需要重复接种，免疫剂量大，成本增加。