[发明专利]大豆北方茎溃疡病菌的RAA荧光检测法及所用引物探针及试剂盒

权利要求书

1.RAA荧光法检测大豆北方茎溃疡病菌的探针，其特征在于：

所述探针为5’端序列/荧光报告基团//C THF//淬灭基团/3’端序列；其中：

所述5’端的核苷酸序列为：CAGCTGTCTGCGTGCGGCCATTTGCGCCGCAT；

所述3’端的核苷酸序列为：TCACACCTGGAGGCG；

所述THF为1个碱基位置；

所述荧光报告基团选自FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5中的任一种；

所述淬灭基团选自TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL中的任一种。

2.根据权利要求1所述的RAA荧光法检测大豆北方茎溃疡病菌的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：CAGCTGTCTGCGTGCGGCCATTTGCGCCGCATCATCACACCTGGAGGCG。

3.大豆北方茎溃疡病菌RAA荧光法检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1或2所述的探针以及上游引物和下游引物；

上游引物的核苷酸序列为：CATCGAGAAGTTCGAGAAGGAAGGTTAGTG

下游引物的核苷酸序列为：GCGACGGCAGGTGTGGTAAGAGTGGTGGCGGAAATG。

4.根据权利要求3所述的大豆北方茎溃疡病菌RAA荧光法检测试剂盒，其特征在于：所述探针终浓度为0.02～0.05mM，所述上游引物及下游引物终浓度均为0.05～0.1mM。

5.根据权利要求3或4所述的大豆北方茎溃疡病菌RAA荧光法检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括试剂RAA基础荧光通用反应试剂和反应缓冲液。

6.根据权利要求5所述的大豆北方茎溃疡病菌RAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液包括：浓度为450mM的Tris-HCl Buffer(pH7.6)；260mM的MgAc；10％W/V的PEG10000。

7.根据权利要求6所述的大豆北方茎溃疡病菌RAA荧光法检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括如下试剂：阴性质控品、阳性质控品和/或临界阳性质控品；

所述阳性质控品含为大豆北方茎溃疡病菌的基因组DNA片段，浓度为1.0×10⁴Copies/ul；

所述临界阳性质控品为含大豆北方茎溃疡病菌的基因组DNA片段，浓度为1.0×10³Copies/ul；

所述阴性质控品为不含有大豆北方茎溃疡病菌的基因组片段的试剂。

8.使用如权利要求3～7任一所述的试剂盒检测大豆北方茎溃疡病菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)、提取待测样品的DNA；

(2)、反应Buffer配制：取47μL反应缓冲液，加入2μL探针与引物的混合物，充分混均；将配制好的49μL试剂加入到已分装冻干的RAA基础荧光通用反应试剂冻干粉的管中，使其充分溶解并混均；再加入1μL待测样品DNA为模板，总体积为50μL，充分混均；

(3)放入检测FAM荧光检测仪器中进行实时RAA荧光法反应；实时RAA荧光法反应条件设定为：反应温度39℃，反应时间5～20min；

(4)结果分析：

在反应时间之内FAM荧光检测仪器检测到信号明显增加，即增加量为荧光起始量的30％，显示有扩增判定为阳性；反之，则判定为阴性。