[发明专利]大豆北方茎溃疡病菌的RAA荧光检测法及所用引物探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种RAA荧光法检测大豆北方茎溃疡病菌的探针以及含有上述探针和上、下游引物的试剂盒；本发明还公开了利用上述试剂盒检测大豆北方茎溃疡病菌的方法，包括如下步骤：提取待测样品的DNA；反应Buffer配制：该反应Buffer中含有探针、引物、待测样品DNA；放入检测FAM荧光检测仪器中进行实时RAA荧光法反应；在反应时间之内FAM荧光检测仪器检测到信号明显增加，显示有扩增判定为阳性；反之，则判定为阴性。本发明的利用RAA技术能够快速检测大豆北方茎溃疡病菌，操作简便，所用时间大大缩减，不需要大型仪器设备，适用于大规模的筛选。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种检测大豆北方茎溃疡病菌RAA荧光法检测的引物、探针和试剂盒。

背景技术

大豆(Glycine max)是我国重要的油料作物和粮食作物，也是世界上食用油和植物蛋白的主要来源，在我国国民经济中占有重要地位。目前我国大豆产量居世界第四位，但仍然不能满足国内植物油及饲料蛋白加工的需要。随着我国进口大豆的数量逐年递增，各种危害大豆生产的病害传入的风险也逐渐增大。

大豆在我国分布很广，主产区集中在东北三省、黄淮海平原以及长江中下游地区。常年种植面积占粮食耕地面积的8％～10％，仅次于水稻、小麦、玉米，在国民经济中占有重要地位。由于我国大豆生产成本高、质量差和国内市场交易成本高，而美国、阿根廷、巴西等国普遍采用转基因技术，且生产机械化程度高、成本低、含油量高，从而导致大豆进口猛增。2005年，我国首次从宁波检验检疫局查检美国进境大豆发现此批大豆含有大豆北方茎溃疡病菌，进境大豆都携带大量的豆杆、豆荚及其他杂质，带菌的可能性很大。在进境大豆的运输、加工、下脚料的处理过程中都有传播扩散的可能。一旦传入将对我国大豆生产造成严重影响。

大豆茎溃疡病是由大豆茎溃疡病菌感染大豆所引起的疾病，且严重影响大豆的生产，在某些地区损失率高达100％。目前主要分布于巴西、玻利维亚、巴拉圭、美国、阿根廷等美洲地区，在欧洲部分地区如保加利亚、意大利亦有分布，迄今为止，在我国暂未发现大豆茎溃疡病菌，但是从文献相关报道来看，疫情还在不断蔓延，严重影响大豆生产。

大豆茎溃疡病分大豆北方茎溃疡病和大豆南方茎溃疡病，其病原体分别为大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.caulivora，DPC)和大豆南方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum var.meridionalis，DPM)，这两种大豆真菌病害目前严重影响大豆生产及贸易，具有检疫重要性和经济重要性。由于传入风险高，但我国绝大部分地区都适合该病菌生长，因此已经被我国列为检疫性有害生物，由此亟需一种快速简便方法应对口岸进出货物检测。

大豆北方茎溃疡病菌于1950年在美国爱荷华州首次发现，随后在美国南部地区发现大豆南方茎溃疡病菌，两者的区别在于发生地理范围不互相覆盖，分离的病原物的培养形态有差别，且大豆南方茎溃疡病的侵染性比大豆北方茎溃疡病强。

DPC属于子囊菌门、球壳目、间座壳科、间座壳属。该病菌侵染植株后迅速发展形成茎杆环状损伤，并可导致正在生长的植株死亡。发病严重的田块有80％的植株受到侵染，造成严重的经济损失。在美国、阿根廷、巴西、加拿大、巴拉圭、意大利、前南斯拉夫、克罗地亚等欧洲部分国家及地区有发生报道，是国外大豆生产上的重要病害。

目前检测大豆茎溃疡病的方法主要包括分离培养技术、分子生物检测技术等。

1、分离培养技术：

国际种子检验协会(International Seed Testing Association，ISTA)采用该技术检测大豆种子中有无携带大豆茎溃疡菌。其方法如下：挑取表面发白、皱缩的不健康种子，使用1％次氯酸钠溶液消毒30s，然后在灭菌水中漂洗3次，并置于灭菌吸水纸上晾干，在PDA培养基中培养发现有特征性菌落后，可分离培养作进一步鉴定。该方法时间周期长，检出率低。

2、豆杆保湿培养法