[发明专利]一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法

权利要求书

1.一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、血清蛋白细胞的采集：首先，采集确诊煤工尘肺患者的静脉血清样本8-10ml；然后将采集的血清样本在2000-6000rpm、3-5℃条件下进行离心2-5min，收集下层细胞；接着用去离子水清洗收集到的下层细胞，在2000-6000rpm、3-5℃条件下再次离心2-5min；最后，将收集到的下层细胞在-60- -80℃深冷环境下冷冻干燥2-8h获得经冷冻后的血清蛋白细胞；

步骤二、血清细胞内蛋白的提取：①首先，将经过步骤一处理后的血清蛋白细胞样本置于离心管中，加入0.4-1.2mL的细胞裂解液，混匀；然后，加入4-20μL质量比为2-6:1的脱氧核糖核酸核酸内切酶I和内切核糖核酸酶混合溶液，混匀，3-5℃温度下静置反应10-30min；接着，加入5-15μL浓度为70-130mmol/L的苯甲磺酰氟异丙醇溶液，3-5℃温度下静置1-3h；最后，在8000-10000rpm下离心40-60min，取上清液，得到蛋白溶液；

②测定蛋白浓度：采用考马斯蓝染色法得到所述的蛋白溶液蛋白的浓度；

③沉淀蛋白：在步骤二②中的蛋白溶液中加入蛋白溶液体积4-6倍温度为的-10℃- -50℃的二甲基酮水溶液，沉淀10-24h；再离心，弃上清液，沉淀液温度用温度为-10℃- -50℃体积浓度为70%-85%的二甲基酮水溶液洗涤；最后冷冻干燥，-80℃贮存得到干燥蛋白；

④蛋白还原及酶解：首先，向步骤二③所得的干燥蛋白中添加20-60μL浓度为40-60mmol/L的甲基三乙基碳酸氢铵水溶液溶解蛋白；然后，加入1-4μL的2-羧乙基磷酸在50-60℃反应1h，进行还原化处理；接着，加入2-4μL的甲基硫代磺酸甲酯反应10-15min；最后，继续加入浓度为0.2-0.3μg/μL的蛋白酶水溶液20-30μL，36-38℃反应10-20h，进行蛋白酶解；

⑤肽标记：在蛋白酶解液中加入用60-80μL乙醇溶解后的iTRAQ标记试剂，室温反应1h，得到酶解反应混合物；

步骤三、蛋白参数分析：将步骤二⑤中得到的酶解反应混合物加入到液相质谱分析仪的电喷雾单元中，电喷雾单元将酶解反应混合物雾化通过喷嘴喷至检测器中；液相质谱分析仪使用一道激光光束来照射经雾化的酶解反应混合物，使得经雾化的酶解反应混合物中至少一个待测物接收由激光光束所传递的能量而被解吸后沿着一个与该电荷移转路径相交的飞行路径飞行，经雾化的酶解反应混合物会因电荷移转而被电离，并在该电位差引导下，朝向质量分析器移动并被质量分析器接收，以进行质谱定性和定量分析，得到血清蛋白参数分析结果。

2.根据权利要求1所述的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，所述的血清蛋白细胞的收集需空腹条件下采集。

3.根据权利要求1所述的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，所述的液相质谱分析仪的检测条件为：离子化方式：正离子电喷雾模式；电压：1200-2000V；离子源温度：120-180℃；扫描范围：80-3000m/z。

4.根据权利要求1所述的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，所述的考马斯蓝染色法包括：①将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml浓度为95%的乙醇，再加入100ml浓度为85%的磷酸；然后，用蒸馏水补充至1000ml，在3-5℃条件下放置时间不低于6个月；②将标准牛血清蛋白溶液由低浓度到高浓度依次加入考马斯亮蓝G-250溶液得到标准曲线蛋白质样本得到标准曲线蛋白质样本；③将待测样本溶于缓冲溶液中，然后按1：5比例用蒸馏水稀释，如出现沉淀，应过滤除去；④每个标准曲线蛋白质样本中加5ml稀释的染料结合溶液，反应5-30min，染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度；⑤根据标准曲线计算待测样本的浓度。

5.根据权利要求1所述的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，所述的细胞裂解液包括：8mol/L的尿素，质量浓度为4%的3-[(3－胆酰胺丙基)－二乙胺]-丙磺酸，40mmol/L的三羟甲基氨基甲烷，余量为去离子。

6.根据权利要求1所述的一种煤工尘肺患者血清中蛋白参数分析方法，其特征在于，所述的iTRAQ标记试剂进行肽标记时，血清的含量不小于500µL。