[发明专利]一种抗体复合物的制备方法

说明书

本发明公开一种抗体复合物的制备方法。本发明通过在冰冻条件下实现C端‑C端连接的二价或双特异性抗体复合物的制备，条件温和，反应速度快，收率较高。相比常规方法所生产的C端‑N端连接的二价或双特异性抗体复合物本发明能够得到更高的亲和力，相比现有制备C端‑C端连接的二价或双特异性抗体的二硫桥接法或点击化学法，本发明具有更好的特异性和稳定性，同时步骤较少，表现在只在C端生成的醛基进行连接，生成的腙键或肟键在生理条件下稳定并且用还原剂还原后不可逆。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种C端-C端(羧基端-羧基端)连接的二价或双特异性，以及多价或多特异性抗体复合物的制备方法，特别是纳米抗体复合物的制备方法。

背景技术

到目前为止，美国FDA已经批准超过50个单克隆抗体药物进入市场，这些药物在癌症，感染，自身免疫性疾病等病症的治疗上发挥了巨大的作用。据统计，2013年全球抗体药物的销售额达到750亿美元，占据全部生物药物销售额的一半。除了已经上市的单克隆抗体外，还有超过300个抗体处于研发当中。在这些抗体中，以抗体片段合成多价，多特异性的工程抗体由于其更优的特性正在占据越来越高的比重(Holliger,P.and P.J.Hudson(2005).Engineered antibody fragments and the rise of single domains.NatureBiotechnology 23(9):1126-1136)。多价或多特异性抗体相比抗体单体而言具有以下几方面的优势。第一，因为具有多抗原结合部位，多价或多特异性抗体具有更高的亲和力，所以以在体内或体外结合靶标分子更加快速和稳定。第二，由于分子量增加，从而延长在体内循环的的半衰期，使得药物作用时间变长。第三，多特异性抗体能够识别不同的抗原，这赋予了常规抗体所没有的新功能。例如应用于特异性T细胞募集(bispecific T cell engager,BiTE)以杀伤肿瘤细胞，其中以单链可变区抗体(Single chain fragment variable,scFv)作为单元构筑的双特异性抗体(Blinatumomab)能够有效的治疗白血病和非霍奇金淋巴瘤，已于2014年底由美国FDA批准上市。除此之外多特异性还被广泛应用于治疗体内多种毒素或病原体以及体外诊断等领域，具有广阔的应用前景和市场。

现有制备二价或双特异性，以及多价或多特异性抗体大部分采用的是重组基因表达技术，具体表现为将抗体片段的基因序列顺序连接起来，抗体基因序列之间插入柔性肽段的基因如甘氨酸丝氨酸重复序列或天然抗体铰链区的序列，以提高抗体单元的自由度(Cuesta,A.M.,et al.(2010).，Trends in Biotechnology 28(7):355-362)。这种常规方法虽然已经被广泛的应用，但是其技术属性决定其只能合成C端-N端(羧基端-氨基端)连接的多抗体复合物。由于抗体活性区域大多在N端附近，所以C端-N端连接的方式容易造成N端的空间位阻影响抗体的活性(van Lith,S.A.M.,et al.(2017)，Bioconjug Chem 28(2):539-548)。因此，发展C端-C端连接的技术是最为理想的方式。现有C端-C端连接的技术多采用二硫键桥接和点击化学法，二硫键桥接法多不稳定而且易受本地二硫键影响，而点击化学法过程较多而且复杂(Witte,M.D.,et al.(2012)，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 109(30):11993-11998)，因此急需发展一种简便的稳定的C端-C端连接技术。

现有多价或多特异性抗体的构筑单元主要有scFv和纳米抗体(nanobody,singledomain antibody,sdAb)两种。纳米抗体也称单域抗体，是发现于骆驼科体内的一种抗体分子。其大小只有常规单克隆抗体的十分之一，却具备与其相当的抗原结合能力；在稳定性，原核表达，结合隐藏抗原表位等方面更胜一筹。由于相比scFv具有更小的结构，所以纳米抗体更加适合做为多价或多特异性抗体的构筑单元，具有广阔的应用前景和市场(Muyldermans,S.(2013).Vol 82 82:775-797)。