[发明专利]一种嵌合抗原受体T细胞及其培养方法

说明书

本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞及其培养方法，所述嵌合抗原受体T细胞经由CD3单克隆抗体和Retronectin联合包被的细胞培养器材培养得到；其中，所述CD3单克隆抗体的浓度为2‑6μg/mL，所述Retronectin的浓度为16‑24μg/mL；本发明通过将Retronectin和CD3单克隆抗体进行联合，通过大量实验摸索得到二者匹配增效的适宜浓度，将其联合包被培养器材后能显著刺激细胞的增殖和分化，提高转染效率，结合完整培养体系的各步骤各条件协同增效，最终有效简化培养步骤，缩短细胞培养时间，具有广阔的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明涉及免疫细胞制备技术领域，尤其涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其培养方法。

背景技术

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)T细胞疗法是一种新型的细胞免疫治疗，是近两年取得显著进展的治疗肿瘤的技术。其基本原理是通过基因工程技术，将设计好的CAR基因转入T细胞的基因组中，T细胞就可以表达相应的CAR结构，从而增强其对肿瘤细胞的识别杀伤能力。CAR结构是将识别肿瘤抗原的可变单链区域scFv(抗原受体)、共刺激信号都嵌合到T细胞的激活信号通路CD3ζ链上(如图1所示)，CART细胞就可以不受主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)的限制直接识别肿瘤细胞表面抗原，同时激活T细胞信号转导通路，从而杀伤特定的肿瘤细胞。

CN107686831A公开了一种针对胰腺癌的Car-T细胞制备方法，该方法包括如下步骤：采集患者外周血，提取外周血单个核细胞(PBMC)；将PBMC用PBS洗涤，弃去上清液，取细胞沉淀中加入GT-T551重悬；将PBMC以1x10⁶个/孔接种于24孔板中，于每孔中加入培养液和60IΜ/mL IL2，培养24-36h，之后每孔板中加入20-40μL-PersonGenTM生物膜；每隔16-18h将培养的细胞分孔一次，每孔补充培养液1-2mL，每隔36-48h补充PersonGenTM生物膜10-15μL，持续培养16-18d。但该现有技术的培养周期较长，极大提高了培养成本。CN102676453A提供了一种培养NK和/或NKT细胞的方法，包括如下步骤：将离体的NK和/或NKT细胞接种到如下培养体系A中培养，即得到增殖的NK和/或NKT细胞；所述培养体系A由含有抗CD3抗体和/或Retronectin的缓冲液和诱导因子组成。该发明将提取的PBMC经过磁珠分离富集后，获得高纯度的CD56⁺细胞，在体外培养体系中加入Retronectin和CD3mAb两种蛋白共同刺激，同时辅以IL-2和IL-15两种因子诱导，建立一个可获得大量具有高杀伤活力的NK和NKT细胞的培养方法。但该现有技术培养方法复杂繁琐，难以推广应用。

CAR-T细胞治疗血液恶性肿瘤疗效显著，甚至能达到90％以上的完全缓解率，但CAR-T细胞制备过程复杂，培养周期长，成本高。现有技术中，利用CD19CAR-T治疗白血病和淋巴瘤的临床应用时，需要用单采机采血，从而提取出病人体内的一些T细胞，然后在实验室对它们进行基因修饰，将编码这种CAR的基因导入到T细胞，并进行CAR-T细胞的扩增，最后将足够量的CAR-T细胞回输到患者体内，而扩增到如此大的数量可能需要几周时间。作为CAR-T细胞产品制备最受国际认可的Kite、诺华、Juno三大公司，从提取患者细胞，到CAR-T细胞回输进患者体内的过程分别需要16-18天、22-29天、24天左右。FDA已经批准的两款CAR-T疗法分别定价为治疗一次47.5万美元和37.3万美元，普通患者难以承受，鉴于多种难治性癌症的侵袭性质，接受CAR-T细胞治疗，时间绝对是最为关键的一个环节。

因此，亟待改进CAR-T细胞制备过程，简化流程，缩短培养时间，降低成本，使CAR-T细胞免疫疗法得到较好的推广应用。

发明内容