[发明专利]一种快速高效获得非转基因的定向基因突变植物的方法和应用

说明书

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种快速高效获得非转基因的定向基因突变植物的方法和应用。通过创制定向基因突变的非转基因植株(简称TKE系统，消除转基因构建体的基因编辑)，步骤为：a)将需要处理的植株通过引入外源核酸分子实施转基因；b)所述a)步骤的包括向植物引入构建体，其含有第一核酸分子和第二核酸分子，其中第一核酸分子为基因编辑元件；第二核酸分子为致死或停止发育元件。可用于植物基因编辑系统如CRISPR/CA S9中，能主动、自动消除植物转基因片段，留出足够时间使基因编辑元件在去除转基因片段之前进行靶向基因编辑，为基因编辑无转基因植株提供简单有效的方法。可用于获得不含转基因片段的定点水稻突变。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种快速高效获得非转基因的定点基因突变植物的方法和应用。本发明的方法可以快速获得不含转基因片段的定点突变水稻，也可以用于快速高效构建集合多种基因突变的非转基因植株。该方法有助于加快水稻基因的功能研究，同时便于进行复杂的多基因互作研究，此外有助于加速改造和聚合水稻中优良基因的育种进度。

背景技术

近年来，随着生物技术的发展，基因组定点突变技术被逐步建立起来，其中主要依赖于一些序列特异核酸酶(Sequence-specific nucleases,SSNs)的功能解析及应用。其中主要包括三种SSN：锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列及其相关系统(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated proteins,CRISPR/Cas system)。这几种SSN的共同特征是能够切割特定的DNA序列，诱导DNA双链断裂(Double-stranded breaks,DSBs)。随后生物体内的自我修复机制会自我启动，将断裂的DNA修复，根据修复方式的不同可以分为非同源重组连接(Nonhomologous end joining,NHEJ)和同源重组修复(homology-directed repair，HDR)(Symington and Gautier,2011)。NHEJ修复方式主要是通过直接将断裂位置的染色体连接起来，但是这个连接修复不能保证非常精确的修复，使得在断裂位置出现核苷酸的缺失或者插入从而导致基因发生突变。HDR修复主要发生在有同源序列存在的情况下，生物体在修复DSBs的时候可以以同源序列为模板来完成断裂位置的修复，这种方式因为有模板的存在，会产生精确的修复，如果在模板中设计一些人为的突变则会将这些突变精确的引入生物体的基因组中。

这几种基于SSN的的基因定点突变技术中，因为CRISPR/CAS9技术操作简单，成本低廉，仅仅通过改变一小段RNA序列即可达到识别不同靶位点，所以CRISPR/CAS9技术被广泛应用于几乎任何可转化的生物体中高效地靶向编辑DNA，为农业改良提供前所未有的工具。自第一次在真核生物中报道CRISPR/Cas9-meidated编辑事件(Cong et al.,2013)以来，CRISPR基因编辑技术在植物中也得到了广泛的应用。从编辑的植物中及时清除转基因片段是评估CRISPR编辑的植物的遗传性和表型稳定性的关键步骤，对于作物改良至关重要。首先，在育种领域，如果在农作物品种中存在转基因片段，那么从政府管理机构获得商业种植的批准就非常困难，转基因的清除是CRISPR编辑作物获取监管批准进行商业应用的先决条件。其次，在研究领域，转基因片段上的基因编辑元件的存在大大增加了脱靶效应的风险，使得表型稳定性成为一个问题。此外，对于遗传学研究来说，转基因片段上的基因编辑元件的存在使得难以确定检测到的突变是从上一代遗传还是由当代新产生的。