[发明专利]传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备及其应用

说明书

本发明涉及基因工程疫苗领域。具体地说，涉及传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备方法及其应用。本发明首次利用原核表达的方式获得了高效价的法氏囊病毒病毒样颗粒，使抗原的生产变得容易，成本低廉而且产量高，效价高，病毒样颗粒同时具有安全性高的优点，具有很大的生产优势。

技术领域

本发明涉及基因工程疫苗领域。具体地说，涉及传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备方法及其应用。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病。幼鸡感染后可引起严重的免疫抑制，对疫苗的免疫应答能力降低，对多种病原体的易感性增强，目前仍然是养鸡业的主要传染病之一。病理特征是胸肌、腿肌出血，法氏囊肿大、出血、坏死、萎缩，肾脏肿大并有尿酸盐沉积。世界动物卫生组织将本病列为B类疫病，我国农业部列为二类疫病。

传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)属于双RNA病毒科(Birn aviridae)禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)。病毒粒子为球形，无囊膜，直径为55～65nm。针对该病，目前商品化的疫苗较多，可分为弱毒疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗。然而各种疫苗都有一些不可避免的缺陷，影响着这些疫苗在实际中的使用。弱毒疫苗模拟自然感染的过程，保护力较好，但是无法避免对鸡的损伤。免疫后，可能导致反应过大并造成法氏囊病。灭活疫苗虽然具有很好的安全性和免疫原性，但由于灭活疫苗中仍然含有病毒DNA，因此存在着免疫毒株与天然毒株发生重组的可能。亚单位疫苗主要是指使用重组法氏囊病病毒衣壳蛋白VP2作为免疫分子的疫苗，但是由于法氏囊病病毒的中和表位依赖于VP2蛋白正确的空间构象，因此这类蛋白的实际保护效力比较有限。为了避免上述这些问题，病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)疫苗成为了一种比较好的选择。

VLPs是由病毒单一或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的蛋白质颗粒，直径大小介于20～150nm，保持了病毒抗原蛋白的天然构象，因而具备激发宿主先天和适应性免疫反应功能。在形态上，VLPs类似未成熟的病毒粒子，但是由于缺乏调节蛋白和感染性核酸，无复制和感染能力。通俗的讲，类病毒颗粒就是去除病毒遗传物质之后剩余物质重新进行装配，结构上仍然具有原病毒特征，但其相对于病毒来说无繁殖能力，也就是无致病力，但仍能使动物机体产生针对该病毒的免疫应答，从而产生抗体使机体对该病毒的侵蚀具有很好的防御能力。在过去的三十年中，病毒样颗粒技术应用逐渐广泛，尤其在疫苗领域。事实上，一些基于病毒样颗粒的疫苗已经用于商业化生产，或者已进入临床研究的不同阶段。三种基于VLP的人用疫苗已经被正式批准用于预防乙型肝炎病毒、人类乳头状瘤病毒和戊型肝炎病毒，另外，基于VLP的动物病毒也在不断开发和被批准，如2型猪圆环病毒VLP疫苗等。

目前，表达与组装VLP疫苗的系统有很多。常用的有大肠杆菌表达系统、杆状病毒表达系统和酵母表达系统等。由于IBDV具有很高的宿主专一性，其病毒颗粒的组装高度依赖于真核宿主的蛋白酶系统和表达系统。因此，杆状病毒表达系统和酵母表达系统已被报道可以用于IBDV-VLP的包装。而原核表达系统(如大肠杆菌表达系统)和真核表达系统差异巨大，因此使得IBDV-VLP的包装难度巨大。如果能实现大肠杆菌表达系统用于IBDV-VL P的包装将能加大的降低IBDV-VLP的生产成本。

IBDV的衣壳蛋白为VP2，其空间构象多变，不同的构象可组装成不同大小的VLP，如T＝1的正二十面体(直径约20nm)、T＝13的正二十面体等(直径约60nm)。其中只有T＝13的正二十面体为天然病毒的正确构象并能够产生有效的中和抗体。本研究采用大肠杆菌表达系统，重组表达IBDV-VP2蛋白，并在一定的条件下使其包装成正确的T＝13的正二十面体VLP。

发明内容

针对目前存在的各种问题，本发明提供了一种传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备方法，方法简单，可大量制备法氏囊病毒病毒样颗粒。