[发明专利]一种皮张中古DNA的提取方法及试剂盒

权利要求书

1.一种皮张中古DNA的提取方法，包括样品预处理步骤、消化蛋白步骤、吸附步骤及洗脱步骤；其特征在于：包括如下步骤：

S1样品预处理步骤：通过该样品预处理步骤获得清洁、无外源有机质污染的皮张样品；

步骤S1所述的样品预处理步骤包含：

S1-1：采用紫外处理过的无DNA、RNA污染的刀片或剪刀剔除掉皮张表层的毛发，并取20～30mg皮张，剪碎为1mm³皮张颗粒；

S1-2：将所述皮张颗粒置于低蛋白吸附离心管中，加1mL～2mL的70～80％乙醇，高速震荡洗涤，以＞12000rpm离心0.5min～2min；执行此步骤至少2次；

S1-3：将步骤S1-2离心管敞口静置于37～40℃培养箱中，充分去除残留的乙醇；

S2消化蛋白步骤：将protein K/EDTA消化液加入盛装有皮张样品的离心管中，封口密封，于35～38℃下振荡、温育过夜，以消化本步骤反应体系中的大分子蛋白；高速离心处理去除未溶解的皮张样品，留取上清液；

所述消化蛋白步骤采用protein K/EDTA消化液，所述protein K/EDTA消化液为包含蛋白酶K、EDTA、Tween 20的水溶液；所述protein K/EDTA消化液中，蛋白酶K的浓度为0.20mg/mL～40mg/mL，EDTA浓度为0.40mol/L～0.60mol/L，Tween 20的体积分数为0.03～0.08％；

S3吸附：取一定量的所述上清液至盛装有Binding buffer和乙酸钠溶液的离心管中并混匀得混合液，接着将该混合液转移至容纳有带滤膜的吸附柱的离心管中，低速离心处理，使上清液中DNA与滤膜结合，少量小分子蛋白被该滤膜吸附；

所述吸附步骤采用的吸附体系包含Binding buffer、乙酸钠溶液、以及浸泡于所述Binding buffer和乙酸钠的混合液中的带滤膜的吸附柱；所述Binding buffer为包含盐酸胍、无水乙醇、Tween 20的水溶液；所述滤膜为硅基质滤膜；S4纯化：将所述带滤膜的吸附柱转移至新的离心管中，中速离心处理并弃去离心产出的清液，去除去滤膜上吸附的小分子蛋白；

S5清洗纯化：加PE缓冲液至所述吸附柱的滤膜，中速离心处理并弃去离心产出的清液，再次去除滤膜上吸附的小分子蛋白；执行本步骤至少1次；

S6洗脱：将盛装所述带滤膜的吸附柱的离心管进行高速离心干燥，再转移所述带滤膜的吸附柱至另一新的离心管内，加TET洗脱液至所述滤膜上，静置、高速离心；离心产生的清液重新加载至该滤膜上，再次静置和高速离心，将滤膜上的DNA洗脱，得到含DNA的溶液；所述洗脱步骤采用TET洗脱液，所述TET洗脱液是包含三羟甲基氨基甲烷-HCl、EDTA、Tween 20的水溶液；

所述低速离心是指离心转速为1000～2000rpm；中速离心是指离心转速为5000～7000rpm；高速离心是指离心转速为12000～14000rpm。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述Binding buffer中，盐酸胍的浓度为3～7mol/L，无水乙醇的体积分数为30～50％，100％Tween 20的体积分数为0.03～0.08％。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述乙酸钠溶液为2～4mol/L，其使用量为Binding buffer体积的2～5％。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述TET洗脱液中，三羟甲基氨基甲烷-HCl的浓度为0.005～0.015mol/L，EDTA浓度为0.0008～0.0012mol/L，Tween 20的体积分数为0.03～0.08％。