[发明专利]一种皮张中古DNA的提取方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种皮张中古DNA的提取方法，包括样品预处理步骤、消化蛋白步骤、吸附步骤及洗脱步骤；所述消化蛋白步骤采用proteinK/EDTA消化液，所述protein K/EDTA消化液为包含蛋白酶K、EDTA、Tween 20的水溶液；所述吸附步骤采用的吸附体系包含Binding buffer、乙酸钠溶液、以及浸泡于所述Binding buffer和乙酸钠的混合液中的带滤膜的吸附柱；所述Binding buffer为包含盐酸胍、异丙醇或无水乙醇、Tween20的水溶液；所述滤膜为硅基质滤膜；所述洗脱步骤采用TET洗脱液，所述TET洗脱液是包含三羟甲基氨基甲烷‑HCl、EDTA、Tween 20的水溶液。本发明方法与现有技术相比，在古皮张样品相同情况下，可获得现有技术12倍以上DNA分子总量，因此可用更少的皮张样品用量，提取效率更高。

技术领域

本发明涉及一种DNA的提取技术领域，尤其涉及一种古DNA的提取方法及试剂盒。

背景技术

古DNA是指保存于古生物遗骸中的遗传物质。随着分子生物学的出现，古DNA研究也逐渐进入了考古工作者的视野，为现代与古代生物间谱系发育关系提供直接证据，同时也为研究人类起源与迁徙、动植物的家养与驯化以及农业文明的起源和早期发展等问题提供一个新视角。然而，古DNA的成功提取一直是其中的重点和难点。这主要是由于受保存时间和保存状态的影响，古DNA的含量相对较低且极易受有机物质污染降及解。在此基础上，针对古DNA的提取技术也受到了各种制约，提取的成功与否很大程度上决定了研究的深度和广度。据以往经验，考古遗址中经常会发现动物毛皮，这对研究古代动物与现代动物之间的遗传关系，揭示家养动物的起源与驯化具有重要意义，而考古现场发现或博物馆保存的皮张又因长时间的降解影响，进一步加大了提取难度。

皮张古DNA提取技术可为珍稀动物保护遗传学研究提供基础。目前，绝大部分珍稀濒危动物的种群生存状况已相当脆弱，已不允许破坏性取样，因此利用馆藏标本样品用于保护遗传学和系统进化等方面的研究成为解决这一难题的重要途径。虽已有学者从馆藏陈旧皮张标本中成功提取了DNA，但因陈旧皮张中DNA相对含量低及污染问题，使这些方法往往存在着标本样品用量大、提取效果差、实验周期长和操作步骤繁琐等不足。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的皮张中古DNA的提取方法及试剂盒，能够实现提取时皮张样品用量少、DNA污染低、提取效率高、操作时间短、操作简单、内源DNA获取量较大等目标，从而为考古学研究、珍稀动物保护研究和其他相关领域研究提供了技术保障和支持。

为了达到上述目的，本发明主要通过选择使用高效的消化液和吸附缓冲液(DNAbinding Buffer)，获取更多的古DNA信息，尤其是不易捕获的短片段DNA信息。由此，既避免了古DNA的污染问题，同时又能高效、便捷地获得含有古DNA的溶液。

本发明采用的主要技术方案如下：

一种皮张中古DNA的提取方法，其包括：样品预处理步骤、消化蛋白步骤、吸附步骤及洗脱步骤；其中：

所述消化蛋白步骤采用protein K/EDTA消化液，所述protein K/EDTA 消化液为包含蛋白酶K、EDTA、Tween 20的水溶液；

所述吸附步骤采用的吸附体系包含Binding buffer、乙酸钠溶液、以及浸泡于所述Binding buffer和乙酸钠的混合液中的带滤膜的吸附柱；所述Binding buffer为包含盐酸胍、异丙醇或无水乙醇、Tween 20的水溶液；所述滤膜为硅基质滤膜；

所述洗脱步骤采用TET洗脱液，所述TET洗脱液是包含三羟甲基氨基甲烷-HCl、EDTA、Tween 20的水溶液。

优选地，所述protein K/EDTA消化液中，所述protein K/EDTA消化液中，蛋白酶K的浓度为0.20mg/mL～40mg/mL，EDTA浓度为 0.40mol/L～0.60mol/L，Tween20的体积分数为0.03～0.08％。