[发明专利]crRNA介导的CRISPR/Cas13a基因编辑系统在肿瘤细胞中的应用

说明书

本发明公开了一种crRNA介导的CRISPR/Cas13a基因编辑系统在肿瘤细胞中的应用。本发明的Cas13a蛋白在U87胶质瘤细胞系中，可以由单链的crRNA介导到互补的目的RNA上，并进行切割。同时，Cas13a蛋白还能够在真核生物细胞中触发连带剪切的效应，即在开始切割第一条目的RNA之后，Cas13a蛋白对其他遇到的RNA，进行无目的的随机切割，从而起到降低肿瘤细胞指数，抑制小鼠成瘤率和肿瘤大小等抑制和杀伤肿瘤的作用。本发明提供了一种抑制或杀伤肿瘤细胞的新方法，为CRISPR‑Cas13系统随机剪切效应在真核细胞中的应用奠定了基础。

技术领域

本发明涉及DNA重组技术，更具体地是一种crRNA介导的CRISPR/Cas13a基因编辑系统在肿瘤细胞中的应用。

背景技术

短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shot palindromicrepeat，CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins，Cas)是古生菌和细菌的获得性免疫系统。Cas蛋白主要分为两大类：获得性模块(adaptation module)和效应模块(effector module)。获得性模块可以将外源核酸信息导入CRISPR序列中，并生成CRISPRRNAs(crRNAs)，作为系统的向导。效应模块在crRNA的介导下，剪切外源入侵的核酸。在CRISPR-Cas系统中，获得性模块相似度较高，主要包括Cas1和Cas2。相比之下，效应系统的种类较多，根据亚基的数量，主要分为1级系统(Class 1systems,C1)和2级系统(Class2systems,C2)。C1系统是由多个蛋白的复合物结合在一起，共同行使功能的，包括I型，III型和IV型；C2系统则由单独Cas蛋白发挥作用，包括II型和V型。II型CRISPR系统主要使用RuvC和HNH内切酶结构域行使功能，V型CRISPR系统则使用单独的RuvC内切酶结构域，包括Cpf1,C2c1和C2c3等。这些系统都是靶向DNA的。VI型CRISPR系统由单独的C2c2效应蛋白组成，这一蛋白没有脱氧核糖核酸酶结构域，但是有两个核酸酶结构域(Higher Eukaryotesand Prokaryotes Nucleotide-binding domain,HEPN)。因此，C2c2是由RNA介导的靶向RNA的CRISPR效应器，并且是一个单分子的内切核糖核酸酶。进一步的报道证明，C2c2是一个由crRNA介导的单链RNA(ssRNA)内切酶。C2c2的靶向切割既取决于靶向序列，又取决与序列的二级结构。在离体实验中，C2c2-crRNA复合体在被靶向RNA激活并开始剪切后，还能够非特异性的剪切其他RNA。这一系统的特性被应用为体外的核酸检测。同时，来源于Leptotrichia shahii的Cas13a，以其更为高效的RNA酶切活性得到了使用。然而目前在真核生物中，对于Cas13a相关应用的研究基本尚未开始，对于CRISPR/Cas13a系统在真核和肿瘤细胞中的应用，必将产生巨大的价值。

发明内容

本发明为了解决CRISPR/Cas13a系统在真核和肿瘤细胞中应用较少的问题，所提出一种crRNA介导的CRISPR/Cas13a基因编辑系统在肿瘤细胞中的应用。

本发明是按照以下技术方案实现的。

crRNA介导的CRISPR/Cas13a基因编辑系统在肿瘤细胞中的应用。

进一步的，所述CRISPR/Cas13a基因编辑系统在肿瘤细胞中通过触发随机剪切效应抑制或杀伤肿瘤细胞。

进一步的，所述肿瘤细胞为胶质瘤细胞系、胶质瘤突变型细胞或人肾癌细胞系。

进一步的，所述胶质瘤细胞系为人U87细胞、人LN229细胞系或小鼠GL261细胞系；所述胶质瘤突变型细胞为U87EGFR VIII细胞；所述人肾癌细胞系为人ACHN细胞系。

进一步的，所述Cas13a基因在肿瘤细胞中的表达载体为质粒表达载体或病毒表达载体。