[发明专利]一种用于提取沉香高质量DNA的方法

说明书

本发明公开了一种用于提取沉香高质量DNA的方法，包括了沉香样品消毒除杂、液氮研磨、温浴、离心、醇沉、洗涤溶解及定向PCR扩增等步骤，可从含树脂等次生代谢物质的沉香尤其是树脂含量高、形成(存放)时间久及深加工产品(或残留物)中提取高质量的DNA。本发明既提高了沉香DNA的质量和数量，也能从深加工残留物中提取DNA，可直接应用于分子生物学和中药鉴定学的研究，为沉香物种鉴定提供了新方法。

技术领域

本发明属于分子生物学和中药鉴定学领域，涉及沉香DNA提取方法，特别是指一种从含树脂高、形成(存放)时间长及深加工产品(或残留物)沉香中提取DNA的方法。

背景技术

沉香为瑞香科沉香属或拟沉香属植物中含有树脂的木材，是一种名贵的中药。沉香作为药物始载于粱代陶弘景的《名医别录》，具有行气止痛、温中止呕、纳气平喘的功效，主治胸腹胀满疼痛、胃寒呕吐、呃逆、肾虚气逆作喘等症。在流通过程中沉香物种、结香方式等信息缺失，再经加工炮制，因此需要经过鉴定才能判断其品质。传统的“看、闻、烧”方法带有主观意识，基于《中国药典》的沉香检测方法也难以客观的判断基原物种，导致掺杂使假或替代的现象屡见不鲜，对临床用药、海关执法、市场规范造成了极大困扰。

沉香形成时间久，一般需要几年甚至几十年，木材老化严重，大多由死细胞组成，含有大量的次生代谢产物和色素，DNA降解较严重。其高纯度DNA的提取难度较大，常规的方法提取效果差，难以满足在种质资源、结香机理、物种鉴定、遗传进化、系统发育和品种选育等领域的要求，而开展这些研究工作，往往需要获得沉香高质量的DNA，因此高质量DNA的提取是必不可少的一步。此外，其沉香成本过高，重新购买实验沉香样品代价大。因此，迫切需要一种能够适用于提取沉香高质量DNA的方法。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种提取沉香高质量DNA的方法，尽可能去除或降低DNA提取的抑制物，实现树脂含量高、形成(存放)时间久及深加工产品(或残留物)中沉香高质量的DNA释放和富集，为沉香分子标记技术等相关领域的研究提供有效的技术手段。

为实现上述目的，本发明公开了一种用于提取沉香高质量DNA的方法，包括了以下步骤：

(1)沉香样品消毒，除杂，充氮，磨成沉香粉末；

(2)向步骤(1)所得样品中加入DNA提取液，混匀后水浴温浴，室温冷却，再加入DNA分离液，混匀，离心，收集上清液；

(3)向上清液中加入预冷DNA沉淀液，抽吸混匀，静置沉淀；

(4)室温冷却，加入DNA洗涤液，冰浴后转移至DNA吸附柱中，离心，弃去废液；

(5)向步骤(4)的DNA吸附柱中加入乙醇溶液，离心，弃去废液；

(6)使步骤(5)的DNA吸附柱中的溶剂挥发后，加入预热的DNA溶解液，离心，取上清，即得沉香总DNA；

(7)将DNA提取液作为模板DNA，加入到PCR反应体系，定向扩增得到DNA目的片段。

优选的，所述的沉香样品为任何含有沉香DNA的样品。

更优选的，所述的沉香样品为含树脂的沉香、沉香药材、沉香木、沉香属植物组织、沉香深加工产品或沉香深加工残留物中的一种或几种。

优选的，离心工作温度为4-20℃，离心速率4500-12000rpm，时间1-20min；温浴温度为50-65℃，反应时间为3-8h；沉淀温度-20℃，反应时间为12-18h；冰浴时间5-10min；步骤(5)中的乙醇溶液为70-80％乙醇溶液；步骤(4)、(5)和(6)重复操作1-2次。