[发明专利]堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供一种检测堪萨斯分枝杆菌的LAMP引物组，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB。本发明还提供包含上述引物组的检测试剂盒及其检测方法。检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶、阴阳性对照和荧光染料(或显色剂)。检测方法是通过提取待测样品的DNA，然后在DNA聚合酶和引物组存在的情况下，对样品DNA模板在65℃左右进行等温扩增，最后通过实时荧光定量PCR仪检测荧光或加入显色剂观察管内颜色变化来确定待检样品中是否含有堪萨斯分枝杆菌。本发明提供的试剂盒和检测方法具有很好的特异性和灵敏性，扩增快速、高效，易于操作，可用于临床标本中堪萨斯分枝杆菌的快速检测。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及堪萨斯分枝杆菌的快速检测，具体为一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组、检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

堪萨斯分枝杆菌是一种慢生长非结核分枝杆菌，属于Runyon分类法中的Ⅰ群，即光产色群。直接涂片显微镜观察见该菌比较粗大，亦可见颗粒状杆菌形态和菌体栅栏样排列。堪萨斯分枝杆菌在合适的培养基(如米氏培养基、罗氏培养基)上生长大约6周后，可形成粗糙或光滑的中等大小的黄色菌落，随着培养时间延长，菌落颜色慢慢转变为红橙色。堪萨斯分枝杆菌可存在于环境中的水和土壤中，最常见的来源是自来水，一般不会感染人类引起疾病和造成人间传播。但在特殊情况下，如有基础性肺病或患者免疫力低下时，该菌可引起肺部疾病、肺外疾病甚至全身播散性感染。

堪萨斯分枝杆菌感染常见的临床症状包括咳嗽、胸痛、咯血和呼吸困难等，常见的影像学改变为单侧的上肺区段阴影，这些表现与肺结核的临床症状和影像学改变都比较类似，故此类诊断依据在堪萨斯分枝杆菌感染诊断方面都缺乏特异性。在实验室诊断方面，通过培养和生化鉴定可鉴别堪萨斯分枝杆菌与其它分枝杆菌(包括结核分枝杆菌复合物)，但这种传统鉴别方法操作繁琐和耗时较长，而且结果的重复性和稳定性不太理想；γ干扰素释放试验被认为是鉴别结核病和非结核分枝杆菌病的有利武器，但由于堪萨斯分枝杆菌与结核分枝杆菌一样能产生CFP-10和EAST-6，因此γ干扰素释放试验无法鉴别堪萨斯分枝杆菌病和结核病；分子生物学方法能够快速地鉴定堪萨斯分枝杆菌，常用方法包括普通PCR、实时PCR和DNA探针杂交等，但目前这些方法都需要使用PCR仪等特殊仪器，而且有些方法使用的扩增靶位也缺乏很好的特异性，这些不足导致临床对研发应用堪萨斯分枝杆菌检测新方法的需求更为迫切。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是本世纪初问世的一种新的核酸扩增技术，该技术进行核酸扩增时无需变换温度，在等温条件下即可完成整个扩增反应，而且最终的结果判断可通过肉眼观察颜色变化即可实现，因此LAMP不需要能够精确控温和进行荧光监测的PCR仪等特殊设备。因为LAMP能够弥补PCR法某些方面的不足，所以该技术在结核分枝杆菌临床检测方面已得到了广泛应用，但目前在堪萨斯分枝杆菌检测方面LAMP尚未得到应用。

发明内容

有鉴于此，本发明所解决的技术问题在于提供一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组。

本发明所解决的技术问题还在于提供一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测试剂盒。

本发明所解决的技术问题还在于提供一种利用上述堪萨斯分枝杆菌LAMP检测试剂盒检测堪萨斯分枝杆菌的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一方面，本发明公开了一种堪萨斯分枝杆菌的LAMP检测引物组，针对堪萨斯分枝杆菌特有的ECHT基因编码序列设计并优化，所述检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB，其核酸序列分别如下所示：

外引物F3：5’-GACTGTTGGCGAGTTGGT-3’

外引物B3：5’-GTCCTGGAACGTCTGCTC-3’