[发明专利]一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备皮肤浅表性肿瘤的药物中的应用

说明书

本发明公开了一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备皮肤浅表性肿瘤的药物中的应用。具体涉及对大肠杆菌进行Trail基因转化从而表达Trail蛋白，提取其外泌体，溶菌酶处理后，再用靶向肽修饰纳米粒并装载光敏感剂吲哚氰绿ICG。将该纳米粒透皮给药后，采用近红外光触发ICG发热并释放单线态氧，与Trail蛋白协同杀死肿瘤细胞。该外泌体的制备方法克服了传统方法的不足，具有产量高、周期短、成本低、载药简便，载药量高等优点。目前尚无将外泌体应用于透皮给药的报道，该外泌体能高效透皮，为治疗皮肤疾病提供了新策略。此外，临床上尚无治愈黑色素瘤的疗法，该外泌体透皮后，可以结合光热与生物疗法协同抑制黑色素瘤的发展与转移，具有良好的体内治疗效果。

技术领域

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种外泌体、外泌体的制备方法及其在制备皮肤浅表性肿瘤的药物中的应用。

背景技术

经皮给药是指将药物直接作用于皮肤表面，使药物穿透皮肤进入人体血液循环，或作用于患者局部皮肤部位，从而发挥治疗作用的一种给药方法。对于皮肤性疾病，尤其是浅表性肿瘤是一种较理想的给药途径。因为这种经皮给药方式具有将药物直接送达病灶，增强给药靶向性，减少对全身的毒副作用；避免肝脏的首过效应，提高了药物的生物利用度；给药方式简单，对人体伤害较小，在发生不良反应时可以随时停止给药等优势。

然而，皮肤致密的角质层是药物穿透皮肤的最大障碍，限制了绝大部分药物的经皮渗透。只有一小部分小分子药物才能直接进入表皮层，大分子药物，如蛋白质，核酸，多肽等，由于其自身的亲水性、较大的粒径等，几乎无法穿透角质层。促进大分子药物穿透皮肤的方法有物理促渗法，如离子导入法、电穿孔、微针法、超声波法等，缺点是技术繁琐，成本昂贵，普遍应用性较差；化学促渗法，如使用氮酮，表面活性剂等，具有皮肤刺激性大，促渗效果不理想的缺点。近些年来，大量的研究报道了使用纳米药物载体携载药物促进药物透皮的方法，它主要是通过影响角质层脂质流动性能，提高药物的分配系数或溶解度等方式改变药物的渗透能力。然而这些纳米粒子的透皮效果不是很理想，绝大部分还需要结合外加磁场或光热治疗等物理手段来促进透皮效果；生物相容性差，也会给皮肤造成一定的刺激性。因此亟需发明一种透皮效果理想，生物相容性好的纳米粒子来携载药物进入皮肤。

外泌体是指由细胞分泌到细胞外微环境的一种具有膜结构的直径约为20-200nm的囊泡，是细胞在向外出芽和细胞膜裂变的过程中释放出的含有胞膜成分的微小颗粒。其中含有蛋白质，核酸等多种关键组分，参与细胞间的通讯并调控细胞功能，具有良好的生物相容性、储存和运输方便、能增加被包裹药物的稳定性、减小用药剂量及可以通过修饰粒子表面产生主动靶向等性质。由于外泌体是来源于细胞膜的纳米囊泡，其成分与细胞膜具有高度的相似性，根据相似相溶和膜融合原理，外泌体应具有细胞和组织穿透的独特优势，而且其粒径较小，易于通过毛细血管，血脑屏障等生物屏障，因此外泌体在经皮给药这一给药途径中可能具有很大的潜力，目前还没有将外泌体应用于经皮给药的研究。

真核细胞外泌体的制备工艺繁琐，生产效率低，成本高，难以产业化。大肠杆菌能够分泌外泌体，分泌速度快，产量高，且制备方法相对简单，周期短，可快速获得大量的外泌体。采用溶菌酶处理大肠杆菌外泌体，通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁溶解破裂，大大减小大肠杆菌源外泌体的免疫原性。此外，目前外泌体载药方式为电穿孔或超声振动方式，具有技术要求高，操作复杂，成本昂贵，载药量低等瓶颈问题。由于外泌体中含有大量母细胞中的成分，包括含有母细胞中转染成功表达的蛋白质，核酸等大分子药物，可以采用将目的基因直接转染母细胞，提取其外泌体的方式进行外泌体载药。大肠杆菌是高效制备重组蛋白的较理想的工程菌。采用Trail基因转化大肠杆菌的方法可产生大量Trail目标蛋白，用于后续的肿瘤治疗。