[发明专利]同时检测血液中L-谷氨酸和L-天冬氨酸含量的方法

权利要求书

1.一种同时检测血液中L-谷氨酸和L-天冬氨酸含量的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(一)标准溶液A和标准溶液B的标定

首先用移液器分别移取20μL至少三种不同浓度标准工作液A和10μL混合内标工作液分别置于离心管中混合制成至少三种不同浓度的标准溶液A，将上述标准溶液分别在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀1-2min后，加入沉淀蛋白试剂100μL，并在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀2-4min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，得到上清液，分别移取上述上清液，利用高效液相串联质谱仪对上述上清液进行检测，得到至少三种不同浓度的L-谷氨酸和内标物的标准溶液A的色谱图，从上述每种浓度的L-谷氨酸和内标物的标准溶液A的色谱图中分别得到L-谷氨酸色谱峰面积和内标物色谱峰面积，分别以上述至少三个不同浓度的L-谷氨酸色谱峰面积与内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y₁，以上述标准工作液A中的L-谷氨酸浓度与混合内标工作液中的内标物浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x₁，将以上检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y₁＝a*x₁+b，并且得出权重系数a、b；

用移液器分别移取20μL至少三种不同浓度标准工作液B和10μL混合内标工作液分别置于离心管中混合制成至少三种不同浓度的标准溶液B，将上述标准溶液B分别在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀1-2min后，加入沉淀蛋白试剂100μL，并在转速为1500-2000rpm下涡旋混匀2-4min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，得到上清液，分别移取上述上清液，利用高效液相串联质谱仪对上述上清液进行检测，得到至少三种不同浓度的L-天冬氨酸和内标物的标准工作液B的色谱图，从上述每种浓度的L-天冬氨酸和内标物的标准工作液B的色谱图中分别得到L-天冬氨酸色谱峰面积和内标物色谱峰面积，以上述至少三种不同浓度的L-天冬氨酸的色谱峰面积与内标物色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y₂；以上述标准工作液B中的L-天冬氨酸浓度与混合内标工作液中的内标物浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x₂，将以上检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y₂＝c*x₂+d，并且得出权重系数c、d；

上文所述的标准工作液A为含有L-谷氨酸的溶液，标准工作液B为含有L-天冬氨酸的溶液，混合内标工作液为含有L-谷氨酸与L-天冬氨酸同位素内标的混合溶液；

(a)标准储备液A和标准储备液B的配制：

精确称取L-谷氨酸标准品5mg置于10mL容量瓶，用50％甲醇水溶液进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液A，并在-80℃条件下保存，有效期为1个月；

精确称取L-天冬氨酸标准品5mg置于10mL容量瓶，用50％甲醇水溶液进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液B，并在-80℃条件下保存，有效期为1个月；

(b)标准工作液A和标准工作液B的配制

取适量步骤(a)中标准储备液A，用40-60％的甲醇水溶液进行稀释，得到含有5μM-1280μM浓度的L-谷氨酸的标准工作液A，并在-80℃条件下保存，有效期为1个月；

取适量步骤(a)中标准储备液B，用40-60％的甲醇水溶液进行稀释，得到含有0.15625μM-160.00Mμ浓度的L-天冬氨酸的标准工作液B，并在-80℃条件下保存，有效期为1个月；

(c)内标储备液的配制

取L-谷氨酸-2，4，4-d3标准品1mg置于10mL容量瓶，用50％甲醇水溶液进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液C，并在-80℃条件下保存，有效期为1年；

取L-天冬氨酸-2，3，3-d3标准品1mg置于10mL容量瓶，用50％甲醇水溶液进行溶解，并定容于10mL，得到标准储备液D，并在-80℃条件下保存，有效期为1年；

(d)混合内标工作液的配制

取适量步骤(c)中内标储备液C和内标储备液D，用40-60％的甲醇水溶液进行稀释，得到含有25μM浓度的L-谷氨酸-2，4，4-d3和25μM浓度的L-天冬氨酸-2，3，3-d3的混合内标工作液C，并在-80℃条件下保存，有效期为1年；

(二)检测血液的离心

取待检测血液至少5mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上清液得血清或血浆，上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；

(三)待测样品处理

(e)用移液枪移取10μL步骤(d)的混合内标工作液于1.5mL的离心管中，然后加入20μL步骤(二)中所述血清或血浆，再加入100μL的沉淀蛋白试剂，在1500-2000rpm的转速下涡旋混合2-5min后，再在10000-15000rpm的转速下高速离心4-6min，得到上清液，移取100μL即为待测样品；

(四)待测样品的检测

使用高效液相串联质谱仪对上述步骤(e)待测样品进行检测，同时得到上述待测样品的L-谷氨酸、L-天冬氨酸和内标物的色谱图，从上述L-谷氨酸、L-天冬氨酸和内标色谱图中可以得到L-谷氨酸色谱峰面积、L-天冬氨酸色谱峰面积与内标物色谱峰面积，将L-谷氨酸色谱峰面积与内标物色谱峰面积的比值y₁代入上述步骤(一)的标准曲线方程y₁＝a*x₁+b中，通过计算得到待检测样品中L-谷氨酸与内标物的相对浓度x₁，内标物在混合内标工作液中的浓度是已知的，由此计算得到该待样品的L-谷氨酸的浓度；将L-天冬氨酸色谱峰面积与内标物色谱峰面积的比值y₂代入上述步骤(一)的标准曲线方程y₂＝c*x₂+d中，通过计算得到待检测样品中L-天冬氨酸与内标物的相对浓度x₂，内标物在混合内标工作液中的浓度是已知的，由此计算得到该待测样品的L-天冬氨酸浓度，即同时定量检测出该待测样品的L-谷氨酸浓度和L-天冬氨酸浓度。