[发明专利]一种基于FRET的荧光核酸检测方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于FRET的荧光核酸检测方法和试剂盒。本发明的基于FRET的荧光核酸检测方法包括以下步骤：1)混合模板DNA、Primobe^TM、PCR反应母液，根据需要用去离子水找补反应总体积；2)对于实时基因定量检验，设置未知样本的重复反应、标准品梯度、阳性对照和阴性对照；3)启动仪器和软件，设置PCR反应参数和荧光信号采集点；4)进行PCR扩增并在反应过程中采集信号；5)分析数据。本发明提供的靶荧光核酸检测方法具有以下优势：方案简明，特异性强；定量精密；应用广泛，Primobe^TM是一种通用性的、基础性的定量PCR技术方案设计，既可用于实时荧光定量，也可用于其他各类靶基因鉴定。

技术领域

本发明涉及实时荧光定量PCR技术领域，具体是一种基于FRET的荧光核酸检测方法和试剂盒。

背景技术

1992年，Higuchi提出实时定量PCR设想。1996年，美国Applied Biosystems公司实现实时定量PCR技术商品化。实时荧光定量PCR技术具有巨大的优势：它实现了PCR从定性到定量的飞跃；自动化的实时荧光定量PCR仪操作简便，使基因检验易于标准化；采用闭管检测，不需要诸如琼脂糖凝胶电泳等PCR后处理，避免了交叉污染。实时荧光定量PCR技术应用广泛，包括病原体的定量监测及药效评价、基因单核苷酸变异(SNV)分析、肿瘤基因检测和诊断等，至今仍然是临床基因检验的主流技术，在生物学和医学基础研究、疾病诊断、新药开发、农业、食品、环保等各个领域都被广泛应用。

实时荧光定量PCR技术从原理上主要分为染料法、引物法和探针法三种。

(1)染料法：染料法利用荧光染料与核酸双链的结合来对核酸进行定量，简便易行，不需要探针。能与核酸双链相结合的嵌入型荧光染料主要有SYBR Green I、SYTO 9、BEBO、BOXTO等，它们与核酸双链结合后发出的荧光强度，比游离状态或者与核酸单链结合时强，所以可用于检测定量核酸。

(2)探针法：探针法的理论基础是荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer，FRET)。当荧光供体分子的发射波长与受体分子的激发波长相重叠时，供体的荧光强度减弱，受体的荧光强度增强，这种现象就是FRET。探针法克服了染料法的不足之处，能够区分特异性扩增产物和非特异性扩增产物。荧光探针种类繁多，主要可以分为3类。

(2.1)水解探针。水解探针主要是TaqMan探针，此外还有TaqMan MGB探针、单标记探针等衍生形式。TaqMan探针的5’端标记报告基团(R)，3’端标记淬灭基团(Q)。报告基团种类繁多，常见的有6-羧基荧光素(6-FAM)、六氯荧光素(HEX)及其衍生物VIC、四氯荧光素(TET)、花青素3(CY3)、花青素5(CY5)等等。淬灭基团可以是四甲基罗丹明(TAMRA)、MGB、黑洞淬灭剂(BHQ1、BHQ2、BHQ3)等等。当探针未与模板结合处于游离状态时，探针结构完整，由于探针的设计长度比较短，R与Q接近，二者之间发生荧光共振能量转移，R所发射的荧光被Q淬灭。在PCR过程中，由于Taq DNA聚合酶具有5’->3’外切酶活性，位于上下游引物之间的探针在引物延伸过程中被切断，导致R和Q溶解于缓冲液中，相互远离，FRET无法完成，R的荧光恢复。TaqMan MGB探针与标准TaqMan探针的差别有两点：第一，其淬灭基团由发光的TAMRA升级成不发光的NFQ(无荧光淬灭基团)，降低了本底，提高了信噪比，从而提高了核酸检测的灵敏度。第二，淬灭基团与探针之间连接有DNA小沟结合物MGB，当探针与靶核酸结合时，MGB与DNA双链相结合，形成局部三链，从而提升了探针的Tm值，增加了探针杂交的特异性。单标记探针只在探针的5’端标记有由带有荧光素的铋螯合物构成的发射基团。铋螯合物游离时发出的荧光比连接有单链寡核苷酸时强。在PCR过程中，铋螯合物被TaqDNA聚合酶的5’->3’外切酶活性切断而游离出来，发出较强的荧光信号，从而实现对靶核酸的定量分析。