[发明专利]人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试剂盒

说明书

本发明公开一种人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒采用Taqman探针的荧光定量PCR法。该试剂盒分别设计了SMN1基因第7和第8外显子，以及内参基因RPP40的特异性引物和探针。本试剂盒可以直观、准确、快速地对SMN1基因的第7和第8外显子进行检测，从而实现SMA正常人和患者的区分，作为人类脊髓性肌萎缩症的辅助诊断，适合推广应用。

技术领域

本发明涉及分子检测领域，是一种用于检测人类脊髓性肌萎缩症SMN1基因第7和第8外显子缺失检测的引物探针组、试剂盒及方法。

背景技术

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy, SMA）是常见的染色体隐性遗传病，脊髓前角细胞变性导致肌无力和肌萎缩，临床表现为进行性、对称性的四肢和躯干肌肉无力、萎缩，患者最终死于呼吸衰竭和肺部感染，居致死性常染色体遗传病第二位。该病在新生婴儿中的发病率约1/6000至1/10000，正常人群的携带率约1/40至1/50。根据患者的发病年龄和病情症状将SMA分为急性婴儿型（Ⅰ型）、慢性婴儿型（Ⅱ型）、少年型（Ⅲ型）、成人型（Ⅳ型）。Ⅰ型是SMA中最严重的一种，通常在出生后6个月内发病，患儿不能独坐和站立，多数患儿在2岁前死亡。Ⅱ型患儿中等严重程度，出生后6~18个月内发病，患儿能独坐，但不能独自站立和行走，其生命一般在2年以上。Ⅲ型患者是慢性SMA，病情较轻，一般18岁内发病，可以独立行走，但比健康儿童晚且不能跑，可存活至成年。Ⅳ型患者的发病年龄约37岁，病情较轻，基本不影响生存。

研究发现，该病的主要致病基因是运动神经元存活基因1（survival motorneuron, SMN1），定位于5号染色体长臂1区3带。SMN基因在全身组织中普遍表达，大部分细胞可以耐受低水平的SMN蛋白，但脊髓前角细胞（脊髓运动神经元）无法耐受低水平的SMN蛋白。90%~95%的SMA患者存在SMN1基因的纯合缺失，5%~10%的患者存在SMN1基因的复合杂合突变，即一条染色体上的SMN1基因缺失，另一条染色体上的SMN1基因存在点突变。人类基因组存在一个和SMN1高度同源的SMN2基因，两者的外显子只存在两个碱基的差异，分别是7号外显子上的C/T和8号外显子上的G/A。SMN1基因的缺失与SMA的临床表型的严重性不相关，SMN2基因的缺失不造成SMA表型，但其拷贝数的对少与SMA表型的轻重呈负相关，即SMN2的拷贝数越多，产生的功能SMN蛋白也越多，病情自然越轻。SMN1基因点突变的类型和分布与SMA的临床表型严重程度密切相关，突变类型有错义突变、移码突变、无义突变和剪接位点突变等。

SMA的常规辅助检查包括肌电图、肌酸磷酸激酶、肌肉活检等，但是SMA的临床变异性大，肌电图在儿童患者易出现不配合检查，活检为有创检查，缺乏特异性易出现误诊。基因诊断能够无创检测致病基因SMN1基因的改变，可以作为SMA很好的辅助诊断。该研究项目即可以适用于SMN1基因纯合缺失，也适用于SMN1基因杂合缺失及检测SMN1基因部分的点突变。因此，该项目可以较广泛地用于不同类型SMA的诊断，且操作简便、特异性强，适用于SMA患者的辅助诊断。虽然大部分患者是由于SMN1基因纯合缺失，但是仍有一部分SMA患者是由于SMN1基因复合杂合突变所致。目前，用于SMA基因检测的方法有限制性片段长度多态性、实时定量PCR、变性高效液相色谱技术、MLPA、Sanger测序等，这些方法多数只用于纯合缺失的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的引物探针组、试剂盒及方法，该基因缺失为SMN1基因第7和第8外显子缺失突变。

本发明的目的可以通过如下技术方案实现：

一种用于人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失检测的引物探针组，其特征在于，所述的人类脊髓性肌萎缩症相关基因缺失为人类脊髓性肌萎缩症SMN1基因第7和第8外显子缺失，该引物探针组包括3对引物和3条探针，所述的3对引物分别为：