[发明专利]一种恒温链置换扩增技术及试剂盒

权利要求书

1.一种恒温链置换扩增技术，包括准备单链DNA模板、生成5’端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环三个阶段，其特征在于使用一对与DNA模板3’-末端序列互补的引物用于DNA模板结合，引物的5’和3’端为与靶序列互补的DNA序列，引物中间含有一段RNA序列，所述引物使延伸产物带有5’端核糖核酸内切酶酶切位点，能够被核糖核酸内切酶识别和水解切割，形成粘性末端，引物与粘性末端连接，在链置换DNA聚合酶作用下延伸3’端，并替代另一条DNA链，被置换链与引物杂交后又依次做为另一扩增反应的靶源，这些步骤在反应体系中不断重复，使靶DNA序列呈指数性增长，所述核糖核酸内切酶为RNase H M0297S，所述引物的5’端和3’端是与靶序列互补的DNA序列，中部为RNA序列，引物5’端与靶序列互补的DNA序列的长度为8-10bp，3’端与靶序列互补的DNA序列的长度为3-5 bp, 中部与靶序列互补的RNA序列的长度为5-7 bp。

2.如权利要求1所述的扩增技术，其特征在于所述链置换DNA聚合酶选自Bst DNAPolymeras。

3.如权利要求1所述的扩增技术，其特征在于所述恒温链置换扩增技术在55-64 ℃恒温反应。

4.如权利要求1-3任一项所述的扩增技术，其特征在于包括如下步骤

（1）单链DNA模板的制备：将靶DNA序列在一定温度下经过热变性形成单链模板T1/T1’；

（2）酶切-链置换等温扩增：

a. 根据靶序列设计一对与靶序列3’-末端序列完全互补的引物，所述引物的5’端和3’端是与靶序列互补的DNA序列，中部为RNA序列；

b. 引物对与单链模板T1/T1’杂交并在链置换DNA聚合酶作用下进行延伸形成双链产物，产物的一条链为模板链 ，一条链为与其互补的带核糖核酸內切酶识別位点的复制链，核糖核酸內切酶识别复制链上相应的识别位点并进行水解切割，形成粘性末端，引物与模板链的3’端互补，引物与粘性末端连接，并在链置换DNA聚合酶作用下进行延伸形成双链产物，同时置换出链T2/T2’；

c. 引物以链T2/T2’为模板，与其3’端互补并在链置换DNA聚合酶作用下延伸形成双链产物；产物的一条链为模板链T2/T2’，一条链为与其互补的带核糖核酸内切酶识別位点的复制链，核糖核酸內切酶识别复制链上相应的识别位点并进行水解切割，引物与模板链T2/T2’的3’端互补，引物与粘性末端连接，并在链置换DNA聚合酶作用下进行延伸形成双链产物，同时置换出链T3/T3’；

（3）SDA循环：

引物分别以T2/T2’和T3/T3’为模板，实现延伸—酶切—链置换循环，使靶DNA序列呈指数性增长；

（4）待反应体系里的dNTP和/或酶消耗殆尽反应终止。

5.一种恒温链置换扩增试剂盒，其特征在于包括核糖核酸内切酶、链置换DNA聚合酶、至少一个引物对、dNTP以及钙、镁离子、缓冲系统和荧光染料，所述引物中含有与靶序列互补的DNA序列，中部为RNA序列，所述引物的5’端和3’端是与靶序列互补的DNA序列，中部为RNA序列，引物5’端与靶序列互补的DNA序列的长度为8-10bp，3’端与靶序列互补的DNA序列的长度为3-5 bp, 中部与靶序列互补的RNA序列的长度为5-7 bp，所述引物使扩增产物带有5’端酶切位点，能够被核糖核酸内切酶识别和水解切割，所述核糖核酸内切酶为RNase HM0297S，所述DNA聚合酶为Bst DNA Polymerase。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述引物对的数量为多种，用于同时扩增多个靶基因序列。