[发明专利]一种恒温链置换扩增技术及试剂盒

说明书

本发明公开了一种新型恒温链置换扩增技术，靶DNA序列经加热变性后，使用一对含有RNA序列的引物与模板DNA单链杂交，在链置换DNA聚合酶作用下延伸引物，产生含核糖核酸内切酶识別位点的靶DNA和RNA结合序列，由耐热核糖核酸内切酶水解切割识别位点，形成粘性末端，引物与粘性末端连接，在链置换DNA聚合酶作用下延伸3’端，并替代另一条DNA链，被置换链与引物杂交后又依次成为另一扩增反应的靶源，这些步骤在反应体系中不断重复，使靶DNA序列呈指数性增长。本发明简便、灵敏、快速、特异性好，可检测低限为数个基因拷贝数的DNA，解决了现有技术下核酸等温扩增的技术缺陷，可广泛用于临床医学、法医学、动植物检疫等领域。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种新型恒温链置换扩增技术及试剂盒。

背景技术

现代分子诊断学产业价值200亿英镑，并且以每年20％的速度增长。核酸扩增技术是分子生物学领域的一项重要的研究手段。PCR(聚合酶链式反应，Science，230，1350-1354，1985)是体外扩增核酸序列最普遍的技术方法，在此基础上分为变温扩增技术以及等温扩增技术两大类。目前变温扩增技术主要包括普通PCR、巢式PCR、多重PCR、实时荧光定量PCR等。这些技术在临床医学，检验医学，基因组学的检测和动植物检疫中发挥着重要的作用。由于核酸的变温扩增技术需要精密复杂的变温分析仪器，对操作人员的专业水平要求比较高且操作过程较繁琐，检测耗时长而不利于在基层推广。而现代医学需要对病原微生物进行快速、准确、及早的检测并确诊。因此建立一种快速、准确、灵敏、操作简便的新型的等温扩增技术对于病原体的检测显得尤为重要。等温扩增成为核酸扩增技术的一个研究热点。

SDA是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术(Walker GT,Fraiser MS,Schram JL et al.Nucleic Acids res,1992；20(7):1691-6)。其基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。其基本过程包括准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环三个阶段。SDA中所用核酸内切酶的切割位点需专一，对识别位点的化学修饰敏感且在打开缺口后能立即解离让位于DNA聚合酶，所用DNA聚合酶有链置换活性，但没有核酸外切酶活性(如cxo-Klenow)。因为3'→5'外切酶活性会使引物单链在反应中降解；5'→3'外切酶活性会使引物-靶序列杂交体中的5'悬端水解。DNA聚合酶需满足如下条件才能用于SDA反应：无外切核酸酶活性；于缺口处启动反应；可利用dNTPas；具有链置换活性，以便提高SDA反应的温度以缩短反应时间、提高反应效率和提高SDA的特异性。与其它的DNA扩增技术相比，SDA有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。SDA的不足之处1)产物不均一，由于在SDA循环中必然产生一些不同的DNA，目前的技术不可能根本消除。2)SDA由于反应原理和反应体系的复杂性，在没有模板存在的情况下，也会产生扩增信号，因此它的特异性不高。3)传统的SDA所用的内切酶需要在模板DNA上有匹配的酶切位点，因此它的灵敏度难以达到临床检测要求4)目前SDA产物的主导方法是荧光偏振检测法。但该检测方法需要特殊仪器——荧光分光光度计。5)SDA可能因标本中含有不明抑制物，使检测不能反映标本中靶DNA的真实含量。复合DNA中高含量靶DNA对低含量靶DNA的竟争抑制现象也很常见。以上的这些不足限制了SDA在临床的广泛应用.

发明内容

为了解决现有核酸等温扩增的技术缺陷，本发明的一个目的是提供一种新型恒温链置换扩增技术。更具体的目的是提供一种在等温条件下高效扩增核酸的低成本的方法，该方法可实现无需核酸抽提即可特异高效扩增。本发明的试剂盒和检测方法，可同时检测至少2种以上的病原体，具有简便、灵敏、快速、特异性好的特点，可广泛用于临床医学、法医学、动植物检疫等领域。

本发明原理：