[发明专利]用于同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组及检测方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于同时检测四种致病弧菌的多重PCR引物组及检测方法和试剂盒，其检测引物组包含检测副溶血性弧菌、创伤弧菌、哈氏弧菌和拟态弧菌的引物对。本发明还建立了一种用于同时检测四种致病弧菌的多重PCR检测方法及试剂盒，利用设计得到的所述引物组，对待测样品中提取的细菌的基因组DNA，在同一反应体系中进行多重PCR反应，通过对反应产物的电泳分析来判定样品中是否含有上述致病弧菌，具有快速准确、成本低、特异性和灵敏度高的优点。

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及同时检测四种致病弧菌的多重PCR检测引物组、检测方法及试剂盒。

背景技术

弧菌(Vibrio)隶属于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌属，弧菌科还包括气单胞菌属(Aeromonas)、邻单胞菌属(Plesiomonas)和发光杆菌属(Photorhabdus)等三个属，他们的共同特点是一群形态呈直或微弯、具有极端鞭毛、动力阳性、氧化酶阳性、发酵葡萄糖的革兰阴性杆菌，除发光杆菌外，其余三属均对人类具有致病性。

弧菌是海洋环境中常见的优势细菌菌群之一，近年来，随着海洋渔业养殖规模的壮大和高密度集约化养殖带来的负因子影响，鱼贝类弧菌病害时有发生，严重阻碍了海洋经济的发展。致病性弧菌因其流行范围广、发病率高等特点成为世界各地海水养殖鱼虾蟹贝类细菌性疾病的首要病原菌，作为海洋渔业病害研究领域的热点之一备受海内外学者关注。20世纪初有研究者对从欧洲鳗鲡中分离到的致病性弧菌做了生理生化鉴定后将其命名为鳗弧菌 (V.anguillarum)，该菌被认为是造成波罗的海鳗鱼红瘟的罪魁祸首，成为较早发现的海洋细菌病原菌之一，迄今为止，被报道过的海洋致病弧菌有数十种之多。

患弧菌病的海鱼多会呈体表发炎、红斑充血，有些甚至会引发体表溃疡、烂鳍烂尾、甚至败血症等症状；感染弧菌的对虾会出现红腿病、白黑斑病、肌肉白油病、烂鲍病、败血症等症状；鲍鱼感染弧菌后其腹足肌会出现脓疱，内脏裸露，肌肉溃烂，上下肌软化腐烂致死；人类由于创口接触海水或者生食海鲜感染弧菌，会出现腹泻、急性肠炎、肢体感染引起的败血症。

副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus,VP)广泛存在于海水和海产品中，是我国沿海地区常见的食物中毒病原菌。副溶血性弧菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。美国亚利桑那大学的Donald V. Lightner教授在全球水产养殖联盟上发表的观点，称发现副溶血弧菌是引起对虾急性肝胰腺坏死病的病原体，该细菌经口传播并宿于对虾胃肠道，产生毒素引起组织损坏和对虾肝功能、消化系统障碍。

创伤弧菌(vibrio vulnificus)是一种栖息于海洋中的细菌，包括两个生物型，生物型1 是人类条件致病菌，与接触和生食贝类有关，生物型2是鳗鱼致病菌，易造成鳃、胃肠道、肝脏、肾脏等出现相应病变。人类一旦感染上，发病急，病情发展很快，75％的患者在入院 48小时内因多脏器功能不全而死亡，被称为“海洋中的无声杀手”，感染后的症状包括呕吐、发烧、腹泻、低血压、肿胀和疼痛等。主要有两种感染途径，一种是进食生的或未经加工熟的贝甲类海产品(尤其是牡蛎)，其危害不在于其引起胃肠炎，而在于其引起的蜂窝组织炎和败血症，死亡率高达50％以上；另一种感染途径是破损的肢体接触海水，或海产品刺伤皮肤而感染。细菌通过破损的皮肤很快速传播，并导致严重的肌炎和肌膜炎引发严重的坏疽，继而发生败血症。

哈氏弧菌(Vibrio harveyi)又称哈维氏弧菌，也有的将其记作夏威夷弧菌，以前曾由 Johnson等将其命名为哈氏贝内克氏菌，1981年Baumann等将其正式归于弧菌属并命名为哈氏弧菌。该菌是一种具有发光特性的弧菌，是海水微生物区系的正常成员，也是海水中一种常见的致病菌，主要引起虾及鱼类的感染发病。