[发明专利]一种用于核酸实时恒温扩增的试剂、扩增体系及其扩增方法和应用在审
| 申请号： | 201810483345.5 | 申请日： | 2018-05-18 |
| 公开（公告）号： | CN108642145A | 公开（公告）日： | 2018-10-12 |
| 发明（设计）人： | 齐飞虎;张翼飞 | 申请（专利权）人： | 上海默礼生物医药科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6844 | 分类号： | C12Q1/6844;C12Q1/70;C12R1/93 |
| 代理公司： | 上海申新律师事务所 31272 | 代理人： | 严罗一 |
| 地址： | 200120 上海市浦东新区周*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 恒温扩增 核酸 逆转录 引物 活性DNA 聚合酶 扩增 荧光探针 应用 实时荧光检测 荧光探针技术 外切酶活性 定量检测 聚合活性 扩增体系 可控的 试剂盒 对靶 探针 | ||
1.一种用于核酸实时恒温扩增的试剂，其特征在于，包括RNA聚合酶、带逆转录活性DNA聚合酶和RNase H；其中，所述带逆转录活性DNA聚合酶具备5'～3'DNA聚合活性和逆转录活性以及5'～3'外切酶活性。
2.根据权利要求1所述的用于核酸实时恒温扩增的试剂，其特征在于，所述带逆转录活性DNA聚合酶选自TtH DNA聚合酶、AS Taq DNA聚合酶、Z05 DNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的用于核酸实时恒温扩增的试剂，其特征在于，所述RNA聚合酶选自T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶和T3 RNA聚合酶。
4.根据权利要求1所述的用于核酸实时恒温扩增的试剂，其特征在于，还包括引物和荧光探针；其中，所述引物包括带RNA启动子识别序列的引物和第二cDNA合成引物，所述荧光探针选自TaqMan探针、Molecular Beacon探针。
5.一种核酸实时恒温扩增体系，其特征在于，包括权利要求1～4中任一项所述的用于核酸实时恒温扩增的试剂以及反应液体系。
6.根据权利要求5所述的核酸实时恒温扩增体系，其特征在于，所述反应液体系包括：Tricine、醋酸钾、醋酸镁、dNTPs、NTPs、DTT、亚精胺、BSA；所述反应液体系的pH值7.8～8.3。
7.根据权利要求6所述的核酸实时恒温扩增体系，其特征在于，所述反应液体系中各组分的终浓度：Tricine 10mM～30mM；醋酸钾50mM～100mM；醋酸镁3～10mM；dNTPs 0.1～1mM；NTPs 0.5～1.5mM；DTT 3～10mM；亚精胺1mM～3mM；BSA 20～40ng；所述引物终浓度为：带RNA启动子识别序列的引物0.2～1mM、第二cDNA合成引物0.2～1mM；所述探针的终浓度为0.2～0.5mM；
其中，在50μL的所述反应液体系中，RNA聚合酶的量为50～200U，带逆转录活性DNA聚合酶的量为0.5～2U，RNase H的量为0.1～1U，RNase A抑制剂的量为10～30U。
8.一种如权利要求5～7中任一项所述的核酸实时恒温扩增体系的扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、带RNA启动子识别序列的引物，在带逆转录活性DNA聚合酶的作用下，以RNA为模板合成DNA链；RNase H特异性识别并切割与DNA结合的RNA，暴露单链DNA；
步骤二、第二cDNA合成引物与单链DNA结合，在DNA聚合酶作用下延伸，形成带RNA启动子识别序列的双链DNA；
步骤三、RNA聚合酶特异性识别启动子序列，并转录RNA，每次转录100～1000copies；
步骤四、带RNA启动子识别序列的引物与新转录的RNA集合，并在DNA聚合酶的作用下延伸，RNase H识别并切割与DNA结合的RNA，暴露单链DNA，第二cDNA合成引物与单链DNA结合，在DNA聚合酶作用下延伸，整个过程循环重复。
9.一种含有如权利要求5～7中任一项所述的核酸实时恒温扩增体系的试剂盒。
10.一种如权利要求5～7中任一项所述的核酸实时恒温扩增体系在核酸定量检测中的应用。
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