[发明专利]一种用于核酸实时恒温扩增的试剂、扩增体系及其扩增方法和应用

说明书

本发明涉及一种用于核酸恒温扩增的试剂，其包括RNA聚合酶、带逆转录活性DNA聚合酶和RNase H；其中，所述带逆转录活性DNA聚合酶具备5'～3'DNA聚合活性和逆转录活性以及5'～3'外切酶活性；该试剂还包括引物和荧光探针，所述引物包括带RNA启动子识别序列的引物和第二cDNA合成引物，所述荧光探针选自TaqMan探针、Molecular Beacon探针。本发明还涉及含有上述试剂的核酸恒温扩增体系及其扩增方法，以及含有该核酸恒温扩增体系的试剂盒及其应用。本发明使用RNA聚合酶、带逆转录活性DNA聚合酶和RNase H实现可控的RNA和DNA恒温扩增，并把该恒温扩增和荧光探针技术结合，其可在对靶RNA的扩增过程中进行实时荧光检测，并且整个过程在同一反应体系中完成，实现核酸的定量检测，适于临床推广和应用。

技术领域

本发明涉及生物化学分子生物学领域，具体为具体核酸扩增检测技术，尤其涉及一种用于核酸实时恒温扩增的试剂、扩增体系及其扩增方法和应用。

背景技术

自1985年聚合酶链式反应(Polymerase Chian Reaction，简称PCR)技术的诞生，极大的促进了核酸检测技术发展。随着酶工艺的成熟，荧光染料出现荧光定量PCR技术在核酸检测领域逐步占主导地位。荧光PCR技术检测核酸时，需要经过反复(约40次)变温过程“95度”～“55～60度”才能实现指数扩增，其扩增量为2n次方。除荧光PCR技术外，有很多恒温扩增技术如NASBA、TMA、LAMP等。

NASBA(Nuleic and sequerce based amplipicain，核酸序列依赖性扩增)和TMA(Transcription Mediated Amplification，转录介导的扩增技术)技术原理相似，最适合单链RNA的扩增，利用RNA聚合酶和逆转录酶，由于RNA聚合酶的转录单次循环可以产生100～1000拷贝的RNA；因此可实现在短时间(15～30分钟)内可将模板扩增约1010倍。

NASBA首先在1990年由Guatelli提出；1991年，Compton J对此进行了详细的描述。该技术基于禽源成髓细胞瘤逆转录酶(Avrienmyeloblastosis virus reversetranscripts，AMV-RT)、RNaseH和T7 RNA聚合酶，在3种酶的共同作用下，以单链RNA为模板进行核苷酸序列的扩增。在两种特殊的引物，dNTP(脱氧核糖核苷酸)，NTP(核糖核苷酸)和缓冲液，引物I 3'-末端与靶序列互补，5'-端含T7RNA多聚酶的启动子，这一引物是用于合成cDNA的。RNase H特异性的切割与单链DNA结合的RNA，暴露cDNA链；这时引物II的碱基序列与cDNA的5'-末端互补在逆转录酶的作用下延伸产生双链DNA，它含有T7 RNA聚合酶的识别序列，并且作为循环相的模板进行RNA的指数扩增。

TMA技术是由Gen probe公司研发的恒温扩增技术，原理与NASBA一致，采用逆转录酶Moloney murine leukemia virus-RT(MMLV-RT)代替AMV-RT。TMA利用RNA聚合酶和逆转录酶(MMLV)在约42度等温反应条件下来扩增核糖体RNA的系统。NASBA和TMA技术，已经广泛应用临床，但这两项技术适合检测单链的RNA或DNA，限制了应用。LAMP技术虽然可以检测DNA和RNA，但是假阳性和扩增不可控性高，引物结构非常复杂，需要多对引物进行扩增，导致特异性大大降低。

中国专利CN200810111479.0采用T7 RNA聚合酶和MMLV逆转录酶使用分子信标(molecular beacon)或TAKARA cycleave探针作为信号系统对靶RNA进行实时扩增。中国专利CN200410025890.8则应用MMLV逆转录的5'～3'外切酶活性，在扩增过程实现对TaqMan探针的水解，从而实现实时荧光检测。但目前并未有任何文献报道采用带逆转录功能的DNA聚合酶而不是逆转录酶AMV或MMLV的实时荧光恒温扩增技术。

发明内容