[发明专利]一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法

权利要求书

1.一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）肽对照品的选择：以分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽为对照品；

（2）检测条件的确定：包括络合物最大吸收波长的确定、线性拟合良好的肽质量浓度范围的确定、体系最适pH的确定和体系最适TCA质量浓度的确定；

（3）标准曲线的建立：以多肽的质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

2.根据权利要求1所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，在步骤（2）中，络合物最大吸收波长的确定包括如下步骤：分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、0.2 、0.5、4.0、8.0 mL于一组50 mL或100mL烧杯中，用14% TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，分别调整pH13.5，立即在波长为470-630 nm范围内手动波段扫描确定最大吸收波长。

3.根据权利要求1所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，在步骤（2）中，线性拟合良好的肽质量浓度范围的确定包括如下步骤：分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、0.1 、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL于一组50 mL或100mL的烧杯中，用14%TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，分别调整pH12.5、13.0、13.5，立即于最大吸收波长处测定吸光值，以肽的质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线并按照肽质量浓度分段进行线性回归，以R²值大小判断线性拟合程度，确定溶液中多肽的最佳检测质量浓度范围。

4.根据权利要求1所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，在步骤（2）中，体系最适pH的确定包括如下步骤：分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、1.0、3.0、5.0 mL于一组50 mL或100mL的烧杯中，用14% TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，调整pH10.5、11.0、 11.5、12.0、12.5、 13.0、13.5，立即于最大吸收波长处测定吸光值，找出pH变化不影响吸光值大小的区域，即为检测最适pH范围。

5.根据权利要求4所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，在步骤（2）中，体系最适TCA质量浓度的确定包括如下步骤：先将罗非鱼明胶置于50-60℃水浴锅中加热溶解，分别取质量浓度为7%的罗非鱼明胶溶液1.0 mL于20 mL的离心管中，立即分别加入10 mL的5%、8%、10%、11%、12%、13%、14%、17% TCA溶液，静置10 min后，于3500 r/min下离心15 min；分别取上清液1.0 mL、2.0 mL和4.0 mL于一组50 mL烧杯中，按照体积比为1:1、1:1、2:1的比例对应加入质量浓度为0.3 mg/mL的3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液1.0 mL、2.0 mL和2.0 mL，每个体积比一组共8份，用对应质量浓度的 TCA溶液补足至12 mL，立即加入8 ml双缩脲试剂，调整最适pH，立即于最大吸收波长处测定吸光值，找出TCA浓度变化不影响吸光值大小的区域，即为TCA最适质量浓度范围。

6.根据权利要求4所述的一种双缩脲法测定罗非鱼源胶原蛋白肽含量的方法，其特征在于，在步骤（3）中，分别取质量浓度为6 mg/mL的分子量为3kDa的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于一组50 mL的烧杯中，用确定的TCA最适质量浓度补足至12 mL，立即加入8 mL双缩脲试剂，调整最适pH，立即于最大吸收波长处测定吸光值，以多肽的质量浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制最适条件下标准曲线并进行线性回归，以R²值大小判断线性拟合程度。