[发明专利]一种高效快速制备游离虾青素的方法

说明书

本发明的公开了一种高效快速制备游离虾青素的方法。本发明生产脂肪酶和酯酶的菌株为铜绿假单胞菌。本发明确定了pH值、反应溶液比例、温度、加酶量和时间等条件。该工艺反应过程中无需添加任何酸碱，既克服了传统皂化法制备虾青素过程易产生副产物虾红素和半虾红素等缺点，又改善了单一酶解法制备虾青素效率低、成本高等弊端，为天然游离虾青素的绿色规模化生产提供一条新的途径。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用产虾青素酯酶生产菌株胞外粗酶制剂高效快速制备游离虾青素的方法。

背景技术

天然虾青素(Astaxanthin，又称3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素)是萜烯类不饱和化合物，是一种类胡萝卜素，主要来源于雨生红球藻、红发夫酵母、虾、蟹等甲壳类动物，为紫红色，易氧化成虾红素(Astacene)。虾青素可以淬灭单线态氧、清除自由基，其抗氧化能力是其他类胡萝卜素的10倍，维生素E的500倍。虾青素具有良好的生理功能，主要功能包括：抗氧化、抗衰老、保护视神经、增强人体免疫功能、减轻脑梗塞危害、消炎作用、预防癌症、心血管疾病和糖尿病等。由于天然虾青素生物功能显著，因此其在食品、水产养殖、医药及化妆品等行业具有良好的应用前景。

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种单细胞微藻，是自然界中虾青素含量最丰富的生物，其虾青素含量可达干重的3.0％甚至更高。虾青素具有多种几何异构体，如9-顺式(9-cis-astaxanthin)、13-顺式(13-cis-astaxanthin)和全反式(all-trans-astaxanthin)，其中全反式构型是最稳定的结构(图1)。雨生红球藻提取的虾青素主要为左旋虾青素(3S、3S’)，左旋虾青素抗氧化性最强，利于吸收，与人体、动物体内所需虾青素结构一致，能最大程度上发挥虾青素的生物功效。雨生红球藻中的虾青素主要以酯类形式存在，约占总虾青素的95％，含有70％的虾青素单酯分子，25％的双酯分子和5％的游离虾青素分子。而虾青素酯的应用受到严重限制，因为虾青素酯中的脂肪酸成分非常复杂，难以对其进行分析鉴定，而且不同脂肪酸链构成的虾青素酯在色素沉积等方面也存在显著的差异。通过水解虾青素酯，制备成游离全反式虾青素具有非常实用的应用价值。

目前水解虾青素酯主要采用皂化法，皂化法反应时间长，反应过程过于剧烈，产物难以控制，并且高浓度碱会对虾青素造成破坏，产生较多类似虾红素和半虾红素等副产物，而且反应过程中的碱和有机溶剂会对环境造成巨大的破坏。另一种方法是酶解法，目前酶解法制备游离虾青素存在水解效率低下、反应时间过长、反应过程较复杂等问题，而且，研究大都集中于单一酯酶或脂肪酶的水解法上。鉴于雨生红球藻中虾青素酯的成分比较复杂，不同脂类水解酶对脂肪酸的特异性存在一定差异，尝试研究使用不同脂肪酸和酯酶间的协同作用水解虾青素酯，将更有利于游离虾青素的制备。

发明内容

本发明的目的是提供一种虾青素酯酶生产菌株胞外粗酶制剂高效快速制备游离虾青素的方法。建立了一种高效、快速、绿色、安全和经济地制备游离全反式虾青素的方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供的菌株为铜绿假单胞菌，可利用铜绿假单胞菌产生的胞外粗酶制剂用来催化水解反应。

一种高效快速制备游离虾青素的方法，按照如下步骤进行：

(1)将铜绿假单胞菌甘油管接种到种子培养液中，35-40℃摇床培养12-48h，然后将0.5-2.0％的种子培养液接种到发酵培养基中，35-40℃摇床震荡培养36-72h；

(2)将培养后的发酵液取出，2-6℃条件下离心处理6-15min，保留上清，去除沉淀，将上清置于-80℃预冻后，放入冷冻干燥机中，冻干后取出酶粉放入干燥器中保藏备用；

(3)取雨生红球藻，用无水乙醇溶解，加入胞外粗酶制剂，溶解于pH为8.5-9.5的缓冲液中，加入到反应容器中，充氮气，避光在35-40℃条件下反应20-40min；