[发明专利]一种嗜热属真菌PCR模板的制备方法

说明书

本申请提供了一种嗜热属(Thermomyces)真菌PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：1)将所述嗜热属真菌的菌丝体悬浮于TE缓冲液中，得到菌体悬浮液；2)将所述菌体悬浮液在90℃以上的温度下加热至少10分钟，得到裂解的菌体悬浮液用作PCR模板。本申请获取嗜热属真菌基因组的方法可以用于嗜热属真菌遗传转化子的PCR鉴定，该方法使用的菌体量小、可缩短转化子的培养时间进而实现在培养早期就可以进行转化子的检测、操作简便快捷、省时省力、经济、且无毒环保，并且后续的PCR灵敏度高，特异性强，为大规模高通量筛选转化子成为可能，以此为基础的快速鉴定嗜热真菌转化子的方法具有重要的科学意义和价值。

技术领域

本申请提供了一种嗜热属(Thermomyces)真菌PCR模板的制备方法。

背景技术

嗜热属真菌(Thermomyces)是一类适宜在45-50℃下生长的温特殊真菌类群，其分布广泛，从地球的热带、亚热带、温带、寒带以及湿润区和干旱区均发现有存在。嗜热属真菌因其细胞内具有一系列独特的酶和代谢产物，使得其在高温条件下具有独特的生存适应能力。又因为其中的许多酶和代谢产物，例如热稳定酶和生物活性小分子，在生产和生活中具有重要的经济价值，使得嗜热真菌成为当前研究热点。

遗传转化是研究生物分子生物学的重要手段。在遗传转化当中，最常规使用的方法主要是通过以转化子的基因组为模板，进行PCR筛选。传统获取真菌DNA基因组模板的方法大都基于CTAB和SDS法，这两种方法需要将大量的菌丝细胞用液氮研磨，不但菌体用量大(50mg以上)，而且操作繁琐且耗时长(1-2个小时)；另外，在提取的过程中用到的苯酚、氯仿等有机溶剂具有一定的毒性，这些因素严重影响了实验进度，不利于大规模高通量筛选转化子，对于嗜热属真菌来说也不例外。

如果能开发出一种使用菌体量小且操作快捷的获取嗜热属真菌基因组模板的方法，为大规模高通量筛选转化子成为可能，发掘快速鉴定嗜热真菌转化子的方法具有重要的科学意义和价值。

发明内容

本申请之一提供了一种嗜热属(Thermomyces)真菌PCR模板的制备方法，其包括以下步骤：

1)将所述嗜热属真菌的菌丝体悬浮于TE缓冲液中，得到菌体悬浮液；

2)将所述菌体悬浮液在90℃以上的温度下加热8分钟至10分钟，得到裂解的菌体悬浮液用作PCR模板。

在一个具体实施方式中，在步骤2)中，加热的温度为97至100℃。

在一个具体实施方式中，在步骤2)中，加热的时间为10分钟。

在一个具体实施方式中，所述方法还包括步骤2)之后的步骤3)，将所述裂解的菌体悬浮液冷冻处理5分钟以上，优选将所述裂解的菌体悬浮液冷冻处理8至15分钟后，恢复至室温得到冷冻处理的裂解的菌体悬浮液以用作PCR模板使用。例如冷冻处理的温度在-20℃以下。

在一个具体实施方式中，所述方法还包括步骤4)，将步骤2)中的所述裂解的菌体悬浮液或步骤3)中的冷冻处理的裂解的菌体悬浮液离心，得到上清液作为PCR模板。

在一个具体实施方式中，所述菌丝体与所述TE缓冲液的质量体积比为(0.1mg-10mg)：100μl。

在一个具体实施方式中，所述TE缓冲液包括8mM至12mM的Tris-HCl和0.05mM至0.5mM的EDTA，所述TE缓冲液pH值为7至8。

在一个具体实施方式中，所述TE缓冲液包括10mM至12mM的Tris-HCl和0.1mM至0.2mM的EDTA，所述TE缓冲液pH值为7.5至7.8。

在一个具体实施方式中，所述嗜热属真菌为嗜热杜邦菌(Thermomyces dupontii)和/或嗜热棉毛菌(Thermomyces lanuginosus)。