[发明专利]一种新型抗菌鱼饲料的制备方法

权利要求书

1.一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：

步骤一：确定基因cp2-2酶切位点和引物，所述引物包括上游引物为5’-CGAGCTCCGAGTGCCCAAAATCA-3’和下游引物为5’-ACTCGAGTCAGTCAAATCTTTTGC-3’，从条纹斑竹鲨脾脏提取RNA，利用引物进行特异性扩增，得到cp2-2目的片段；

步骤二：将步骤一获得的cp2-2目的片段与质粒pET-32a的菌株扩大培养后提取质粒DNA，将质粒DNA分别用SacI和XhoI双酶切、纯化回收，将回收得到的cp2-2目的片段和载体片段pET-32a连接，获得连接产物；

步骤三：取5μL步骤二获得的连接产物转化至200μL大肠杆菌Rossetta感受态细胞中，吹打混匀，再依次进行冰浴30min，42℃热击90s，冰浴5min，然后加入LB液体培养基1mL，37℃摇床1h后，经Amp和CM抗性LB固体培养基筛选阳性克隆，经鉴定后得到重组表达质粒pET-32a-cp2-2；所述步骤三中重组质粒pET-32a-cp2-2的鉴定方法包括质粒PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定，先选取菌液提取质粒DNA，对提取的质粒DNA分别进行质粒PCR和用SacI和XhoI进行双酶切鉴定，然后选取经质粒PCR和双酶切鉴定均正确的菌株进行测序鉴定；

步骤四：将步骤二获得的重组表达质粒pET-32a-cp2-2进行重组蛋白诱导表达，再进行纯化、鉴定，获得cp2-2重组蛋白；

步骤五：将步骤四获得的cp2-2重组蛋白添加到普通的鱼饲料中，搅拌均匀，获得一种新型抗菌鱼饲料；

其中，提取条纹斑竹鲨脾脏RNA：采用试剂盒mRNAIsolationKit提取条纹斑竹鲨脾脏RNA，具体操作步骤如下：

1）制备10μl体系：包括4μl的RNA/mRNA，2μl的5xqRTSuperMix，4μl的Nase-freeWaterR；

2）将RNA逆转录成cDNA：

将上述10μl体系依次置于25℃条件下10min，42℃条件下30min，85℃条件下5min，使得RNA逆转录成cDNA；

其中，cp2-2特异性扩增为PCR扩增， PCR扩增具体操作步骤如下：

1）制备50μl体系：包括5μl的10×Buffer，5μl的dNTP（ACTG),3μl的Mg2+，2μl的P1，2μl的P2，1μl的Term，1μl的Taq以及31μl的ddH2O；

2）将上述50μl体系依次序置于95℃条件下10min，95℃条件下30s，58℃条件下30s，72℃条件下60s，72℃条件下10min，10℃条件下保存，变性、退火、延伸30个循环。

2.根据权利要求1所述的一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤四中重组蛋白诱导表达条件为在28℃条件下，利用浓度为1mM/L的IPTG诱导4h。

3.根据权利要求1或2所述的一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，其特征在于，所述步骤四中纯化方法为Ni柱亲和层析挂柱纯化。