[发明专利]一种新型抗菌鱼饲料的制备方法

说明书

本发明公开的事一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，属于生物工程技术领域，该方法包括获取目的基因片段、构建重组表达质粒、制备重组蛋白以及重组蛋白与鱼饲料的混合，本发明成功构建了重组原核表达质粒，成功获得重组蛋白可溶性表达，明确该蛋白具有抑菌效果，将其运用于鱼饲料的制备中，解决了鱼类养殖过程中存在的死亡率高、污染大等问题，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种鱼饲料的制备方法，更具体一点说，涉及一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

目前，市场上的鱼饲料普遍使用抗生素作为饲料添加剂以降低鱼养殖过程的死亡率，但是由于抗生素的大量使用导致其大量残留于鱼的体内，既影响鱼的出口市场，也影响鱼养殖业本身发展，对抗生素的滥用不仅增强了鱼的抗药性，还对水质造成了严重的污染。因此，市场上急需一种鱼饲料可以与细菌、病毒或毒素等异源性物质结合而发挥预防和治疗鱼类疾病的作用，并且绿色、安全，无污染无残留无公害，可显著缓解目前鱼类养殖过程中存在的问题。

条纹斑竹鲨(Chiloscylliumplagiosum)俗称狗鲨、犬鲨，属于软骨鱼纲(Chondrichthyes)、须鲨目(Orectolformes)须鲨科(Orectolebidea)、斑竹鲨属(Chiloscyllium)，是一种小型底栖颌类脊椎动物，早在5.3亿年前便存在，是硬骨鱼类的祖先。它具有软骨鱼类和硬骨鱼类共有的特性，即复杂的生理系统、适应性免疫系统和加压循环系统，条纹斑竹鲨具有较强的免疫系统，其体内会产生一种只含有重链的抗体，称为单域抗体，与传统抗体不同的是单域抗体仅是一个通过铰链区与Fc区连接的抗原结合部位，这个抗原结合区自抗体分离后仍具有结合抗原的功能，并且具有稳定性高、渗透性好的特点，因此，通过筛选条纹斑竹鲨的基因，构建表达质粒，在原核微生物中表达纯化，获得具有抗菌效果的蛋白，并将其作为添加剂加入鱼饲料中可以获得一种新型抗菌鱼饲料。

发明内容

本发明的目的在于解决上述技术问题，提供具有绿色、安全、无污染、无残留无公害，且可以预防和治疗鱼类疾病等技术特点的一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，

一种新型抗菌鱼饲料的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

步骤一：确定基因cp2-2酶切位点和引物，所述引物包括上游引物为5’-CGAGCTCCGAGTGCCCAAAATCA-3’和下游引物为5’-ACTCGAGTCAGTCAAATCTTTTGC-3’，从条纹斑竹鲨脾脏提取RNA，利用引物进行特异性扩增，得到cp2-2目的片段；

步骤二：将步骤一获得的cp2-2目的片段与质粒pET-32a的菌株扩大培养后提取质粒DNA，将质粒DNA分别用SacI和XhoI双酶切、纯化回收，将回收得到的cp2-2目的片段和载体片段pET-32a连接，获得连接产物；

步骤三：取5μL步骤二获得的连接产物转化至200μL大肠杆菌Rossetta感受态细胞中，吹打混匀，再依次进行冰浴30min，42℃热击90s，冰浴5min，然后加入LB液体培养基1mL，37℃摇床1h后，经Amp和CM抗性LB固体培养基筛选阳性克隆，经鉴定后得到重组表达质粒pET-32a-cp2-2；

步骤四：将步骤二获得的重组表达质粒pET-32a-cp2-2进行重组蛋白诱导表达，再进行纯化、鉴定，获得cp2-2重组蛋白；

步骤五：将步骤四获得的cp2-2重组蛋白添加到普通的鱼饲料中，搅拌均匀，获得一种新型抗菌鱼饲料。

作为一种改进，步骤三中重组质粒pET-32a-cp2-2的鉴定方法包括质粒PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定，先选取菌液提取质粒DNA，对提取的质粒DNA分别进行质粒PCR和用SacI和XhoI进行双酶切鉴定，然后选取经质粒PCR和双酶切鉴定均正确的菌株进行测序鉴定。

作为一种改进，步骤四中重组蛋白诱导表达为在28℃条件下，利用浓度为1mM/L的IPTG诱导4h。