[发明专利]一种基于磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶及其抑制剂的方法

说明书

本发明涉及一种磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶及其抑制剂的方法，属于纳米生物传感技术领域。室温下，在DMF和去离子水的混合溶剂中加入谷胱甘肽(GSH)、硫酸铜(CuSO₄)制备具有磷光特性的铜纳米簇(Cu NCs)。细胞色素C(Cyt c)通过静电作用会使得Cu NCs的荧光强度降低。在制备的Cu NCs中加入Cyt c孵育的胰蛋白酶。Cyt c会被胰蛋白酶水解，胰蛋白酶的存在有效的抑制Cyt c对Cu NCs的淬灭作用。因此，通过荧光强度变化来实现对胰蛋白酶的定量检测。此磷光铜纳米簇探针具有合成简单，反应快，且对胰蛋白酶的检测具高灵敏度、很好的化学稳定性以及生物兼容性的特点。

技术领域

本发明涉及一种基于磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶及其抑制剂的方法，属于生物传感技术领域。

背景技术

胰蛋白酶(trypsin)是一种从胰脏提取的丝氨酸蛋白水解酶。胰蛋白酶在生物体内含量变化直接反应了胰脏功能的运作和病例变化，是脊椎生物体内一种十分重要的蛋白酶。因此，发展简单、快速、精准的胰蛋白酶活性检测，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。目前，有多种方法用于检测胰蛋白酶例如：酶联免疫吸附法、凝胶电泳法、质谱分析法、比色法以及荧光分析法。以上检测方法普遍存在检测限低，价格昂贵，操作复杂等不足。因此，基于酶蛋白相应底物的荧光分析法响应快速，操作方法简单，受到了广泛的关注和重视。细胞色素C是一种被广泛认知的血红素电子传输蛋白，在线粒体呼吸链中扮演者重要的角色。细胞色素C可以被胰蛋白酶消化水解成血红素肽碎片，是胰蛋白酶的自然底物。因此，常用于胰蛋白酶的荧光检测。

金属纳米团簇由数个以至数十个金属原子组成，尺寸接近电子费米波长，是一种新型的荧光纳米材料。由于金属纳米团簇超小的尺寸，使其具有出色的尺寸效应，优秀的光物理特性和催化效果。从生物探针到催化剂，LED到光电池，金属团簇在多个领域有着广泛的研究和应用。其中金属铜纳米簇具有更高的反应活性；与分子蛋白及酶更高的关联性。越来越多的应用于生物荧光检测领域。

综上所述，结合金属铜纳米簇稳定的荧光特性和生物关联性，通过铜纳米簇与细胞色素C具有相互作用，使用细胞色素C作为反应底物，实现一种绿色快速的荧光分析胰蛋白酶及其抑制剂的方法具有重大的意义。

发明内容

本发明解决的技术问题是：提出一种绿色无污染的，灵敏快速的，使用具有磷光特性的聚集态磷光铜纳米簇与细胞色素C定量检测胰蛋白酶以及其抑制剂的方法。

为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种磷光铜纳米簇检测胰蛋白酶的方法，其特征在于:包括如下步骤：室温下，取DMF和去离子水配置混合溶液，取谷胱甘肽溶液加至混合溶液，再加入硫酸铜溶液，振荡形成铜纳米簇。配置细胞色素C于离心管中，取不同浓度胰蛋白酶加入细胞色素C放入振荡箱孵化。取孵化后细胞色素C加入铜纳米簇，充分振荡，室温放置。不同浓度胰蛋白酶水解后的细胞色素C降低铜纳米簇荧光强度不同，以此定量检测胰蛋白酶。

具体为：包括如下步骤：取DMF和去离子水配置混合溶液，DMF/水体积比例为2：1。将20μL谷胱甘肽(0.2M)加入到480μL混合溶剂中，轻轻摇晃至均匀。再加入硫酸铜溶液(500μM)，振荡形成铜纳米簇。配置细胞色素C于1mL离心管中，取不同浓度胰蛋白酶加入细胞色素C总体积为500μL，混合溶液中胰蛋白酶浓度为0-1mg/mL，细胞色素C浓度为0-3mg/mL，放入振荡箱37℃孵化0.5-2小时。取孵化后细胞色素C 20μL加入铜纳米簇，充分振荡，室温放置0.5-2小时。不同浓度胰蛋白酶水解后的细胞色素C降低铜纳米簇荧光荧光强度不同，以此定量检测胰蛋白酶。