[发明专利]用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物及鉴别方法

说明书

本发明公开一种用于鉴别紫海胆‑中间球海胆杂交种的PCR引物，核苷酸序列如下：上游引物：5'ttttatctcctccctttttatytct3'；下游引物：5'cctcwaaagtagttaagattgggac3'；鉴别方法依次按照如下步骤进行：提取具有紫海胆外形的待鉴别海胆个体DNA；将提取的DNA稀释至10 ng/μl为模板，以上游引物及下游引物进行PCR扩增，所述PCR反应条件为：94℃5min；94℃30s、50℃30s、72℃2min，35个循环；72℃5min；对PCR扩增产物进行电泳，出条带则为紫海胆‑中间球海胆杂交种。

技术领域

本发明涉及分子标记领域，尤其涉及一种用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物及鉴别方法。

背景技术

中间球海胆（Strongylocentrotus intermedius）又称虾夷马粪海胆，原产于日本北方及俄罗斯远东部分沿海地区。与其它可食用海胆种类相比，中间球海胆具有性腺色泽好、不饱和脂肪酸含量高、口感甜润等特点，深受东南亚地区消费者喜爱，市场需求量逐年增加，目前已在辽宁、山东等地形成养殖规模。研究显示，中间球海胆的最适生长水温为15℃~20℃，当水温升高到23℃时，会引起中间海胆的大量死亡。紫海胆（Anthocidaris crassispina）是自然分布于我国南方海域的海胆种类，对高温环境具有较高的耐受性。实验证实，以紫海胆(♀)和中间球海胆(♂)为亲本杂交产生的紫海胆-中间球海胆杂交种，相较于紫海胆具有优于母本的性腺品质，相较于中间球海胆又具有明显的耐高温潜力，是一种生长快速、耐高温性好、性腺品质卓越的海胆新品种。然而，由于紫海胆-中间球海胆杂交种与紫海胆具有相似的外观，很难用肉眼区别，容易在养殖中出现混淆问题。因此，有效地鉴别紫-中杂交海胆和紫海胆是海胆养殖与市场经营中亟待解决的重要问题。

目前，鉴定海胆种类的方法主要有两种：一种是根据海胆的外部形态特征，如壳形、体型对称性、口的位置、步间带和间步带幅宽比例及弧度，管足孔数及其排列方式等，该方法属于传统分类鉴定方法，不仅需杀死海胆，鉴定效率低，而且不适合具有相似外观的紫海胆-中间球海胆杂交种与紫海胆的鉴定；另一种是通过分子生物学方法，通常是利用基因组测序，通过比较基因组学的方法，大规模筛选特定的分子标记，这种方法的优势是鉴定的准确率较高，不足是花费巨大、耗时长，对操作分析人员的专业性和仪器设备精密度都有很高的要求。

线粒体基因组是真核生物细胞核基因组以外的遗传系统，是研究分子进化和物种系统发生的重要对象。相比复杂的核基因组而言，线粒体基因组所含的基因数目较少，获取容易，操作相对简单。但是，迄今为止并没有应用线粒体DNA序列对紫海胆-中间球海胆杂交种进行鉴别的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物及鉴别方法。

本发明的技术解决方案是：一种用于鉴别紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物，其特征在于核苷酸序列如下：

上游引物：5' ttttatctcctccctttttatytct 3'

下游引物：5' cctcwaaagtagttaagattgggac 3'。

一种上述用于鉴别紫海胆与紫海胆-中间球海胆杂交种的PCR引物的鉴别方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 提取具有紫海胆外形的待鉴别海胆个体DNA；

b. 将提取的DNA稀释至10 ng/μl为模板，以上游引物及下游引物进行PCR扩增，所述PCR反应条件为： 94℃ 5min；94℃ 30s、50℃ 30s、72℃ 2min，35个循环；72℃ 5min；

c. 对PCR扩增产物进行电泳，出条带则为紫海胆-中间球海胆杂交种。