[发明专利]一种分离筛选人体肠道中发酵乳杆菌的培养基及其应用

权利要求书

1.一种分离人体肠道样品中发酵乳杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）富集培养：取0.1~0.5g肠道内容物，在无菌条件下加入至培养基中，35℃~37℃厌氧条件下富集培养18~24h；所述培养基为：每L按照重量计包含如下成分：蛋白胨 8~15 g，牛肉膏 8~15 g，酵母粉 3~10 g，吐温80 1~3 g，磷酸氢二钾 2~3 g，乙酸钠 2~5 g，柠檬酸二铵 1~3 g，七水硫酸镁 0.4~0.6 g，一水硫酸锰 0.15~0.25 g，阿拉伯糖 8~20 g，万古霉素15~25×10^-3 g，链霉素0.2~0.3g，庆大霉素6~8×10^-2 g，L-半胱氨酸 0.4~0.8 g；

（2）梯度稀释：步骤（1）液体管振荡器振荡混匀，取1mL混悬液置于9mL生理盐水中，充分混匀，得到10^-1稀释液，重复上述稀释步骤，依次得到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释液；

（3）涂布培养：分别吸取100μL上述10^-4、10^-5、10^-6三个梯度稀释液于添加琼脂10~20 g的培养基上，用涂布棒涂布均匀，至37℃厌氧条件下培养48 h；

（4）一级纯化培养：取菌落数在30-300区间的稀释涂布平板，每个样本随机挑选10个形态大小各异的单菌落在MRS固体平板上划线，放至37℃厌氧条件下培养48h；

（5）二级纯化培养：取步骤（4）划线平板上单菌落接液体MRS管，至37℃厌氧条件下培养20 h；

（6）菌种保存：将二级纯化培养菌悬液与灭菌60%甘油以1:1比例混合均匀，最终甘油浓度为30%，将混合液分装在冻存管中，冷冻保藏于-80℃超低温冰箱；

（7）菌种鉴定：取步骤（6）剩余菌悬液离心获取菌泥，菌泥用无菌生理盐水重悬清洗后用于16S DNA PCR扩增，扩增序列送测鉴定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基中，每1L含有抗生素的质量为：万古霉素20×10^-3g；链霉素0.256 g；庆大霉素6.4×10^-2g。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，制备上述培养基的方法包括如下步骤：

（1）称取蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，磷酸氢二钾2.6 g，乙酸钠2 g，柠檬酸氢二铵2 g，七水硫酸镁0.5 g，一水硫酸锰0.25 g，阿拉伯糖20 g，L-半胱氨酸0.5 g加蒸馏水定容到969 mL，用HCL调pH至5.0±0.1，110~115℃灭菌15~20分钟；

（2）配制浓度为2mg/mL的万古霉素溶液；配制浓度为6.4mg/mL庆大霉素溶液；配制浓度为25.6mg/mL的链霉素溶液；将上述溶液分别过滤膜灭菌；

（3）将步骤1灭菌后的混合物冷却至50~55℃，加入步骤2中溶液各10mL，混合均匀。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，制备上述培养基的方法包括如下步骤：（1）称取蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉5 g，磷酸氢二钾2.6 g，乙酸钠2 g，柠檬酸氢二铵2g，七水硫酸镁0.5 g，一水硫酸锰0.25 g，阿拉伯糖20 g，L-半胱氨酸0.5 g，琼脂20 g，加蒸馏水定容到969 mL，用HCL调pH至5.0±0.1，110~115℃灭菌15~20分钟；

（2）配制浓度为2mg/mL的万古霉素溶液；配制浓度为6.4mg/mL庆大霉素溶液；配制浓度为25.6mg/mL的链霉素溶液；将上述溶液分别过滤膜灭菌；

（3）将步骤1灭菌后的混合物冷却至50~55℃，加入步骤2中溶液各10mL，混合均匀。

5.权利要求1~4任一所述方法在分离、鉴定发酵乳杆菌方面的应用。