[发明专利]一种分离筛选人体肠道中发酵乳杆菌的培养基及其应用

说明书

本发明公开了一种分离筛选人体肠道中发酵乳杆菌的培养基及其应用，属于微生物技术领域。本发明在传统乳杆菌筛选培养基LAMVAB培养基的基础上，通过替换碳源以及添加浓度0.256×10^‑3mg/mL链霉素和6.4×10^‑6mg/mL庆大霉素，抑制了人体肠道中常见乳杆菌和其它乳酸菌的生长，并保持发酵乳杆菌能在这种培养基中生长。该培养基解决了人体肠道中发酵乳杆菌筛选困难的问题，提高了人体肠道中发酵乳杆菌的筛选效率。

技术领域

本发明涉及一种分离筛选人体肠道中发酵乳杆菌的培养基及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)属于乳杆菌科中的乳杆菌属，为异型发酵乳杆菌，革兰氏染色阳性，代谢类型为兼性厌氧，最适生长温度为30～37℃。发酵乳杆菌是人体肠道常驻菌群之一，主要黏附在小肠上皮细胞。2011年发酵乳杆菌被列入我国《可用于食品的菌种名单》，它还通过美国食品药品监督管理局的GRAS(一般认为安全的物质)认定。其中，发酵乳杆菌CECT5716更是在2016年6月被中国卫生部列入《婴幼儿可食用菌种名单》。

研究表明，发酵乳杆菌作为可用于食品的益生菌菌种之一，可以耐受人体肠道低酸、高胆盐环境，在胃肠道环境中适应能力强。发酵乳杆菌在免疫调节(结肠炎，肠应激综合征等)，拮抗致病菌(沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，念珠菌，链球菌等)，抗氧化，降胆固醇等方面表现出良好的益生作用。发酵乳杆菌作为益生菌，在潜在的益生特性方面具有巨大的研究价值，因此，快速、高效的筛选优良的发酵乳杆菌成为首先要解决的问题，而筛选培养基在筛选过程中最为关键。

目前发酵乳杆菌的筛选来源主要来自健康人体肠道及一些发酵食品。申请号为201610827496.9，名称为“发酵乳杆菌特异性培养基及其应用”的中国发明专利申请，公开了一种发酵乳杆菌特异性培养基及其应用，但该培养基仅可应用于发酵乳制品中发酵乳杆菌的特异性培养，并不适宜对于复杂菌相样品的菌种分离。人体肠道中存在丰富多样的微生物，数量高达10¹⁴，其中超过99％都是细菌，有500～1000个不同的种类。包括发酵乳杆菌在内的乳杆菌是肠道中的重要益生菌，在人体肠道中常见的乳杆菌不少于20种，但往往丰度较低，不易于筛选。目前从肠道内容物筛选乳杆菌最有效的培养基是LAMVAB(Lactobacillus Fermentum MRS with Arabinose and Three Antibiotics)培养基，该培养基通过降低PH和添加万古霉素来抑制乳酸菌外其他杂菌的生长，但它仅限于筛选乳酸菌，无法精确到菌种水平。因此，目前并没有用于分离筛选人体肠道中发酵乳杆菌的特异性培养基。

发明内容

本发明要解决的技术问题，是提供一种提高人体肠道中发酵乳杆菌筛选分离效率的培养基，它含有链霉素，万古霉素，庆大霉素和碳源等物质，能够抑制人体肠道非乳杆菌和其它常见乳杆菌的生长，从而对人体肠道中发酵乳杆菌进行分离筛选。

本发明还提供了人体肠道中发酵乳杆菌的分离筛选方法，利用上述培养基液体管对肠道中发酵乳杆菌先进行富集再稀释涂布在筛选培养基固体平板上，使肠道中丰度非常低的发酵乳杆菌能够快速富集。

为解决上述技术问题，本发明的第一个目的是提供一种人体肠道筛选分离发酵乳杆菌的培养基LFMATA(Lactobacillus Fermentum MRS with Arabinose and ThreeAntibiotics)，按照重量计包含如下成分：蛋白胨8～15g，牛肉膏8～15g，酵母粉3～10g，吐温80 1～3g，磷酸氢二钾2～3g，乙酸钠2～5g，柠檬酸二铵1～3g，七水硫酸镁0.4～0.6g，一水硫酸锰0.15～0.25g，碳源8～20g，万古霉素20×10^-3g，链霉素0.256g，庆大霉素6.4×10^-2g，L-半胱氨酸0.5g，蒸馏水定容到1000mL。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基还含有琼脂10～20g/L。