[发明专利]一种检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR引物及试剂盒

权利要求书

1.一种检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR引物，其特征在于：包括上游引物1和下游引物1，其核苷酸序列如下所示：

上游引物1：gggaaagggagaagtccatagcaat；

下游引物1：tgagccagtagccttcacttcatag。

2.一种包括权利要求1所述引物的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒。

3.根据权利要求2所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括RNA抽提试剂、逆转录酶、Taq DNA聚合酶、标准阳性DNA模版、逆转录反应液、荧光定量反应液。

4.根据权利要求3所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述标准阳性DNA模版为含有乙型脑炎病毒NS5的基因序列的克隆质粒pGEM-NS5，所述乙型脑炎病毒NS5的基因序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

5.根据权利要求4所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述克隆质粒pGEM-NS5的制备方法包括如下步骤：

S1.培养日本脑炎病毒，提取病毒RNA进行逆转录反应制备病毒cDNA，作为PCR反应模版；

S2.利用上游引物2和下游引物2进行PCR反应，扩增NS5基因片段，上游引物2和下游引物2的核苷酸序列如下所示：

上游引物2：gggaaagggagaagtccatagcaat；

下游引物2：cagcagtattcgtgaaagtgttaag；

S3.利用琼脂糖凝胶电泳纯化回收上述PCR反应产物，将其分别连接到克隆载体质粒pGEM-T上，构建重组质粒；

S4.将重组质粒转化感受态细胞，挑阳性克隆培养，提取质粒，测序正确的克隆质粒命名为pGEM-NS5。

6.根据权利要求5所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中的克隆质粒pGEM-NS5的浓度分别为10⁷拷贝数/μL、10⁶拷贝数/μL、10⁵拷贝数/μL、10⁴拷贝数/μL或10³拷贝数/μL。

7.根据权利要求3所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述RNA抽提试剂为TRIzol；所述逆转录酶为SuperScript III Reverse Transcriptase。

8.根据权利要求3所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述逆转录反应液包括1μL oligo(dT)₂₀、4μL 5×第一链缓冲液、1μL 10mMdNTP混合液、1μL0.1M DTT。

9.根据权利要求3所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述荧光定量反应液包括1μL上游引物1、1μL下游引物1、25μL Platinum SYBR Green qPCRSuperMix-UDG with ROX。

10.权利要求3-9所述的检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒的使用方法，其特征在于：该使用方法包括如下步骤：

S1.病毒RNA的提取：将BHK-21细胞接种病毒后培养，取细胞培养上清，加到RNA抽提试剂中，然后加入氯仿，震摇后离心取上层溶液，加入异丙醇，室温放置后离心，用75％乙醇洗RNA沉淀，离心后晾干，溶于DEPC处理的去离子水中得到RNA溶液；

S2.逆转录反应：将逆转录反应液、RNA溶液、逆转录酶混匀进行逆转录反应得到逆转录产物；

S3.荧光定量PCR反应：将荧光定量PCR反应液、逆转录产物、标准阳性DNA模版、Taq DNA聚合酶混匀，进行PCR反应；

S4.读取阳性标准和检测样品的拷贝数。