[发明专利]一种检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR引物及试剂盒

说明书

本发明提供了一种检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR引物及试剂盒，引物包括上游引物1和下游引物1，其核苷酸序列如下所示：上游引物1：gggaaagggagaagtccatagcaat；下游引物1：tgagccagtagccttcacttcatag。本发明所述的试剂盒可以在加入TRIzol试剂将病毒灭活后在普通实验室进行检测，安全方便；对乙型脑炎病毒能定量检测，在病毒拷贝数在100以上时都能检测到，灵敏度高；可用于检测乙型脑炎病毒感染者的样品如血液、脑脊液中的病毒，也可用于乙型脑炎病毒的基础研究及疫苗研制、生产过程中病毒滴度的检测，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于检测乙型脑炎病毒的试剂盒领域，尤其是涉及一种检测乙型脑炎病毒的荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)又称流行性乙型脑炎病毒(Epidemic encephalitis B virus)，是日本脑炎(流行性乙型脑炎，简称乙脑)的病原体。日本脑炎是由蚊虫传播引起人类中枢神经系统感染的病毒性疾病，其病死率高达20％～30％，后遗症较重。我国是日本脑炎发病人数最多的国家，占世界总发病数的80％以上。在动物中，猪是本病的主要传染源，对JEV有扩增作用，JEV感染呈猪-蚊-人的链状，同时日本脑炎也是养猪业的重大疫病之一。

日本脑炎病毒基因组RNA全长约11kb，编码3种结构蛋白，即C蛋白(衣壳/核心蛋白)、prM/M(膜前体蛋白/膜蛋白)和E蛋白(囊膜糖蛋白)，7种非结构蛋白，即NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。E基因大小为1500bp，编码500个氨基酸残基。E蛋白是毒粒表面的重要成分，与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合、保护性免疫、血凝反应和血清特异性有关。NS5是最大的保守蛋白，分子量为105kDa，为碱性蛋白，被认为具有RNA多聚酶的作用。鉴于NS5基因序列的保守性，我们选取NS5基因上的部分序列设计引物，进行乙型脑炎病毒的检测。

乙型脑炎病例的诊断主要依靠流行病学、临床特征和实验室检查三方面的证据。实验室检查包括反向被动血凝抑制实验、间接免疫荧光、酶联免疫吸附实验和病毒分离等方法。然而，这些主要针对抗体的检测方法均不能在疾病早期提供有力的诊断证据。特别是，上述方法均需测定并比较急性期和恢复期的血清抗体滴度，时间跨度长，不利于病人的早期诊断和治疗。RT-RCR方法虽然灵敏并能在早期对病毒进行检测，但是因其步骤繁琐且容易造成污染，从而使用受到限制。

实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的PCR技术相比，实时定量检测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。实时荧光PCR技术通过对扩增曲线以及循环阈值(Ct)的分析，能够对检测样品进行定性和定量分析。实时荧光PCR是将DNA扩增与检测过程融合为一体动态检测DNA扩增的全过程，省掉了PCR后处理过程，大大缩短了结果分析时间，快捷、方便。由于实时荧光PCR采取一种封闭的检测模式，从而减少了气溶胶污染和由此造成的假阳性。因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

荧光定量PCR的检测模式之一为SYBR Green I检测模式。SYBR Green I是一种能与双链DNA结合发光的荧光染料。其与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量，通用性好，并且价格相对较低。由于SYBR Green I与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异性产物的影响，由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I得到定量结果。