[发明专利]一种快速测定液态发酵液中生物量的方法

权利要求书

1.一种快速测定液态发酵液中生物量的方法，其特征在于：用生理盐水对孔板培养后的发酵液沉淀进行清洗后，基于酶标仪以铬黑T双波长显色法对菌体内部的镁离子进行测定，通过镁离子的含量来反映菌体生物量；其具体步骤如下：

（1）在离心无沉淀的发酵培养基中接入孢子，发酵3天后对发酵液进行4500rpm离心10min，弃上清，获得纯菌体的沉淀；离心无沉淀的发酵培养基制备：味精22.33g，硫酸铵9.72g，无水葡萄糖42.50g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20 min；

（2）在离心有沉淀的发酵培养基中接入孢子，发酵3天后对发酵液进行4500rpm离心10min，弃上清，获得菌体和培养基的混合沉淀；离心有沉淀的发酵培养基制备：味精22.33g，硫酸铵9.72g，无水葡萄糖12.50g，籼米粉30.00g，磷酸二氢钾9.00g，一水合硫酸锰0.21g，七水合硫酸镁2.1g，加水定容至1000mL，121℃高压灭菌20 min；

（3）在（1）和（2）中所获得的沉淀分别加入生理盐水，上下颠倒几次将沉淀打散，4500rpm离心5 min弃上清再次获得沉淀；重复操作3次，将发酵液沉淀清洗干净；

（4）纯菌体经过三次清洗后，于水分活度仪上烘干，刮取菌体粉末，在0.29g菌体粉末中加入0.5g二氧化硅粉末和100mL去离子水，超声破碎30min，离心取上清，分别取0、0.2、0.5、1、2、3mL上清液加入0.4mL氨缓冲溶液、0.4mL EBT溶液，去离子水定容至5mL，在酶标仪的560nm、680nm处测定吸光值，计算吸光差值△A=A₅₆₀-A₆₈₀，绘制吸光差值△A与纯菌体质量之间的标准曲线；

（5）在清洗后的菌体和培养基的混合沉淀中加入去离子水，沸水浴5min破坏菌体结构，再加入二氧化硅超声30min使菌体内镁离子溶于水中，4500rpm离心10 min取0.2mL上清液转移至另一个24深孔板中，分别加0.4mL氨缓冲溶液、0.4mL EBT溶液，4mL去离子水，于孔板振荡器上震荡均匀后取0.2mL于96微孔板中，在酶标仪的560nm、680nm处测定吸光值，计算吸光差值△A=A₅₆₀-A₆₈₀，根据吸光差值△A与纯菌体质量之间的标准曲线计算样品中菌体生物量；

其中，氨缓冲溶液制备：0.2g氯化铵于4.4ml浓氨水中，加水定容至100mL，其pH=10.5；EBT溶液制备：铬黑T和草酸钾加去离子水溶解并定容至铬黑T终浓度为0.05wt%，草酸钾终浓度为1wt%。