[发明专利]一种快速测定液态发酵液中生物量的方法

说明书

本发明针对微孔板发酵技术进行生物量的测定，即用生理盐水对孔板培养后的发酵液沉淀进行清洗三次后，基于酶标仪以铬黑T双波长显色法（△A=A₅₆₀‑A₆₈₀）对菌体内部的镁离子进行测定，通过镁离子的含量来反映菌体生物量。本发明克服了微孔板发酵过程中难以用称干重法来表征发酵液的生物量的缺陷，同时基于多种干扰因素的排除，使得本方法的测定值更为贴近实际值，与其他生物量的测定方法（氨基葡萄糖法）具有很强的相关性，同时符合平板菌落计数法中菌量的生长趋势。总之，本发明的生物量测定方法操作便捷，快速准确，能够正确反应发酵过程中的菌量变化趋势，试剂无腐蚀性且用量小，具有很强的应用价值。

技术领域

本发明属于生物量测定领域，具体涉及真菌在液体发酵液中的生物量测定技术。

背景技术

当前生物量的测定方法很多，然而许多生物量的测定方法操作较为繁琐，并且易受菌龄、培养条件、培养基质的干扰，如麦角固醇法等；此外，测定碳源氮源的消耗、呼吸速率、称干重等检测方法并不总能准确地反映生物量的变化情况。qPCR技术虽然既能做到高通量检测，其检测结果又相对准确，但其需要引物设计，难度较大、成本较高，因此构建一种较为准确便捷的菌体生物量的测定方法成为当前急需解决的问题。

由于微生物在培养环境中会对金属离子进行利用，因此可根据菌体中金属离子含量来间接测定菌量。为了简便而迅速地获取检测结果，以便于后续进行高通量检测，本发明采用改进的显色法来对金属离子进行测定。由于常见的培养基中均含有钠、钾、镁离子，而镁离子在菌体内部含量较为稳定，因此可用过菌体内部镁离子含量来推测菌量。

通过一系列的排除干扰的手段来提高本方法测定的准确度，使得以菌体内部镁离子含量来表征菌体生物量成为可能，本方法简单易行，操作便捷，试剂用量小，其检测结果能够很好地反应液态发酵过程中菌量的变化趋势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种真菌液态发酵生物量的快速测定方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

用生理盐水对孔板培养后的发酵液沉淀进行清洗后，基于酶标仪以铬黑T双波长显色法对菌体内部的镁离子进行测定，通过镁离子的含量来反映菌体生物量。

镁离子浓度测定方法的改良：

如图1所示，由于显色剂与络合物的吸收波长有较大的重叠，若单单使用显色剂的消光曲线或络合物的吸光曲线则难以真实反应溶液中镁离子含量，因此，使用双波长法，用△A=A₅₆₀-A₆₈₀来屏蔽络合物最大吸收波长处显色剂的干扰，以此来准确对镁离子进行定量。

钙离子对显色反应的影响：

由于铬黑T显色剂能对钙、镁离子进行络合并显色，因此钙离子的屏蔽尤为重要。本发明对铬黑T显色剂进行了改进，在铬黑T显色剂中加入了草酸钾，草酸钾与钙离子的络合能力比铬黑T强，因此即便显色体系中钙镁浓度比为2：1，依然能够排除钙离子的干扰。

对沉淀物表面的冲洗的必要性：

对生理盐水沉淀表面进行冲洗并离心弃上清。重复清洗3次后，沉淀表面几乎无镁离子。清洗后，才能准确对菌体内部的镁离子含量进行定量测定。

吸光值与纯菌体的菌量之间标曲的绘制：

如图5所示，测定结果显示，双波长的吸光值与纯菌体的菌量之间线性关系良好。故该方法可行。

双波长法与其他真菌测定方法的比较：