[发明专利]一种生物素标记的依布硒啉探针及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种生物素标记的依布硒啉探针的制备方法，其特征在于，所述生物素标记的依布硒啉探针结构式如下所示：

所述制备方法包括以下步骤：

(1)将邻碘苯甲酰氯和对苯二胺进行反应，反应后水洗、分液，水相用CH₂Cl₂萃取两遍后，合并有机相，干燥、旋干、色谱柱分离，得化合物I，结构式如下：

(2)将叔丁氧羰酰基6-氨基己酸、EDCI和HOBT溶解混合，加入三乙胺后，冰浴条件下搅拌均匀，然后加入化合物I，反应24小时，得化合物II，结构式如下：

(3)将碘化亚铜和1，10-邻菲罗啉溶解混合，搅拌均匀后，加入化合物II、硒粉以及碳酸钾，加热反应24小时，反应结束后，将反应液倒入NaCl溶液中，室温搅拌均匀，过滤、水洗、干燥后色谱柱分离，得到化合物III，结构式如下：

(4)将化合物III溶解，冰浴条件下加入三氟乙酸，室温搅拌过夜，得化合物IV，结构式如下：

(5)将生物素、N-羟基丁二酰亚胺和EDCI溶解在DMF中，搅拌均匀，24小时反应后，将混合溶液倾倒在冷水中，所得白色固体即为Biotin-NHS；

(6)将化合物IV和Botin-NHS溶解混合，加入三乙胺，搅拌均匀，24小时反应即得。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中邻碘苯甲酰氯、对苯二胺的体积质量比为1-1.5：2-3；色谱柱分离洗脱剂为CH₂Cl₂和甲醇按体积比35-45：1配制而成。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的步骤(2)中叔丁氧羰酰基6-氨基己酸、EDCI·HCl、HOBT和化合物I的质量比为：1-1.5：0.6-1：0.9-1.4:1.3-2。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的步骤(3)的具体步骤为：反应在氮气保护的条件下进行，将碘化亚铜和1,10-邻菲罗啉溶于DMF中，搅拌均匀，加入化合物II、硒粉以及碳酸钾，110℃加热反应24小时，反应结束后，将反应液倒入NaCl溶液中，室温搅拌均匀，过滤、水洗、干燥后色谱柱分离，得到化合物III；碘化亚铜、1,10-邻菲罗啉、化合物II、硒粉、碳酸钾的质量比为0.13-0.16：0.13-0.16：2-2.5：0.35-0.4：0.8-1.0；色谱柱分离洗脱剂为CH₂Cl₂和甲醇按体积比20-25：1配制而成。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的步骤(4)中，化合物III、三氟乙酸的质量体积比为1-2：5-10。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的步骤(5)中生物素、N-羟基丁二酰亚胺、EDCI的质量比为：1.2-1.5：0.7-0.9：1.2-1.4。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是，所述的步骤(6)中化合物IV、Biotin-NHS的质量比为0.8-1：0.7-0.9。

8.一种检测依布硒啉共价靶向蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)采用超声破碎法对细胞进行裂解，得浓度为2mg/mL的蛋白溶液；将按照权利要求1-7任一所述方法制备的生物素标记的依布硒啉探针加入蛋白溶液中，25℃反应1小时，

(2)将上述步骤(1)反应后的蛋白溶液进行Western blot实验，在膜上观察所标记到的蛋白；

(3)将上述步骤(1)反应后的蛋白溶液用CH₃OH/CHCl₃进行沉淀，然后用冷甲醇进行洗涤；超声复溶，用Streptavidin beads进行富集，用trypsin进行酶切，得肽段；

(4)上述步骤(3)中肽段进行二甲基化标记，并利用高效液相色谱进行碱性分级；

(5)将分级好的肽段进行合并后，利用LC-MS进行数据采集，对数据进行搜库分析。