[发明专利]人血白蛋白高表达的人肝细胞系及其建立方法和应用

说明书

本发明公开了一种人血白蛋白高表达的人肝细胞系及其建立方法和应用，属于基因工程领域。本发明将以提高肝细胞系的合成功能为最终目标，挑选白蛋白表达相关的基因(ALB，基因ID:213)，通过慢病毒转染的方式，使CRISPR/dCas9系统蛋白复合物Synergistic Activation Mediator(SAM)基因组插入到细胞系基因组内，使细胞系稳定表达过表达复合物，从而实现针对白蛋白的过表达调控。本发明建立的人血白蛋白高表达的人肝细胞系可以在生物型人工肝系统中作为细胞源。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，是一种人血白蛋白高表达的人肝细胞系及其建立方法和应用。

背景技术

人工肝支持系统借助于机械的、物理的装置通过清除内毒素、胆红素等有毒物质，补充白蛋白、氨基酸、凝血因子等有毒物质，暂时发挥肝脏的支持作用。临床治疗结果显示：人工肝支持系统能够显著提高肝衰竭的临床治愈、好转率。然而，非生物型人工肝支持系统尚不能完全替代肝脏的合成、代谢功能和生物转化等功能。随着肝细胞的分离培养和保存技术、肝细胞大规模培养技术及生物反应器日渐成熟，以肝细胞为生物活性成分的生物型人工肝(bioartificial liver,BAL)成为人工肝脏研究的热点。生物型人工肝其依靠接种于生物反应器中的肝细胞，可以提供肝脏的分泌、代谢，生物转化和解毒等功能，在理论上讲，几乎可以代替肝脏的全部功能。

白蛋白(albumin，ALB)由肝脏实质细胞合成，占血浆总蛋白的40％-60％，是血清中的主要蛋白质成分。白蛋白在机体中具有重要的生理功能：维持血浆胶体渗透压的恒定；能与体内许多难溶性的小分子有机物和无机离子可逆地结合形成易溶性的复合物，成为这些物质在血液循环中的运输形式；能保证细胞内液、细胞外液与组织液间的交流，起到一种胶体保护的稳定作用；白蛋白是人体内一种重要的营养物质，其体内含量直接关系着肝衰竭病人的预后。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种人血白蛋白高表达的人肝细胞系，命名为HepG2N，其特征在于，所述的人肝细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:C201872，保藏日期为2018年4月10日。

进一步的，所述的人肝细胞系是利用慢病毒载体运载调节蛋白基因组，整合进入原细胞基因组中而得到的细胞系。

进一步的，所述的慢病毒载体一共包括三种慢病毒颗粒，分别运载三种Synergistic Activation Mediator(SAM)蛋白复合体的激活元件的调节蛋白基因组，即dCas9-VP64、MS2-p65-HSF1和靶向特异性sgRNA。

进一步的，所述的激活元件的调节蛋白基因组表达SAM蛋白复合体激活原件，组合成为SAM蛋白复合体。

进一步的，所述的慢病毒载体内包含有筛选基因，也将一同被整合进入原细胞基因组中。

进一步的，所述的筛选基因选自嘌呤霉素Puro、杀稻瘟菌素Blast和潮霉素Hygro。

本发明的第二目的是提供一种人血白蛋白高表达的人肝细胞系的建立方法，包括以下步骤：a)由启动子调控，包含目的基因和筛选基因的质粒；所述启动子选自巨细胞病毒启动子(CMV promoter)，所述目的基因选自：dCas9-VP64蛋白、MS2-P65-HSF1蛋白和靶向特异性sgRNA(ALB)；所述筛选基因选自：嘌呤霉素Puro、杀稻瘟菌素Blast和潮霉素Hygro；

b)将步骤a)得到的质粒分别和psPAX2、pMD2.G共转染293T细胞，包装出LentidCAS-VP64_Blast、Lenti ALB-MS2_Puro和Lenti MS2-P65-HSF1_Hygro三种慢病毒载体颗粒；

c)将步骤b)得到的慢病毒载体颗粒共感染人肝细胞HepG2；

d)筛选活的，带有Puro、Blast和Hygro抗性基因的人肝细胞；