[发明专利]一种检测鉴定昆虫体内Wolbachia感染的特异性引物、方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测鉴定昆虫体内Wolbachia感染的特异性引物、方法和试剂盒。所述特异性扩增引物Tw16s1，包括正向引物F和反向引物R，其序列依次如SEQ ID NO：1～2所示。所述检测方法为：S1.提取待测昆虫总DNA；S2.以S1的DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增反应；S3.将S2的PCR扩增反应产物电泳检测，从而进行判断。本发明所述引物特异性强，扩增产物为单一目的片段，而且灵敏度高，能筛选出假阴性、非特异性的样品，从而提高检出率。从提DNA到获得结果仅需要4个小时左右。可以精确、快速地发现检测出样品中是否受Wolbachia感染，为进一步得用进行疾病预防和对昆虫进行生殖调控提供基础。

技术领域

本发明涉及昆虫体内共生菌的分子检测技术领域，更具体地，涉及一种检测鉴定昆虫体内Wolbachia感染的引物组、方法和试剂盒。

背景技术

Wolbachia是广泛分布于节肢动物生殖组织内的一类共生细菌，约75％的物种感染Wolbachia。Wolbachia与宿主有共生关系，例如引起淋巴丝虫病的丝虫与其体内的Wolbachia是互惠共生关系，Wolbachia控制着丝虫的生长、发育和在蚊子体内的生存。检测出Wolbachia就是防止媒介昆虫传播淋巴丝虫病的首要条件。

另外，Wolbachia还对宿主具有生殖调控的作用。Wolbachia对寄主的作用主要体现在其对生殖的调控方面，在进化过程中与寄主逐渐形成了协同进化的关系(Werren etal.,2008)，形成了多种调节宿主生殖方式的机制。这些机制主要包括：1、引起寄主的细胞质不亲和(Cytoplasmic Incompatibility，CI)，影响着蝇类、蚊类等类群的种内杂交产生很少后代或者没有后代。2、诱导孤雌生殖(Parthenogenetic Induction，PI)；诱导孤雌生殖现象(PI)多发生于单-双倍体性别决定系统的昆虫中。单-双倍体性别决定系统是指在正常情况下，未受精的卵(单倍体)发育成雄性，而受精卵(双倍体)发育成雌性。3、引起雄性的雌性化(Feminization)；4、杀雄作用(Male Killing)是指寄主在发育过程中，雄性胚胎或者幼虫不能成活。检测出Wolbachia就可以利用相关调控机理对害虫进行治理，对益虫进行利用。

目前已报道的检测Wolbachia的方法主要是依靠特异PCR或特异探针杂交技术。其中，16s、wsp、fts这三个基因及其引物是最常用于Wolbachia检测的几种靶标基因。这些引物存在着以下的欠缺：1、假阴性结果，例如wsp引物(81F和691R))。但是Wolbachia在不同的宿主有不同的变异，因此在利用现在的16S引物扩增某些昆虫体内Wolbachia的过程中遇到一些假阴性的结果，导致最后错误的结论。2、非特异性扩增，结合位点过多，PCR结果经常出现非专一的条带，无从判断是否为阳性结果。例如：16s(Wol-16s-F，Wol-16s-R)，wsp引物(81F和691R)和fts引物(ftsZ，ftsA和ftsB)。3、非Wolbachia目标检测，现在常用的16S引物为通用引物，如果PCR扩增出阳性结果后，还需要进一步测序才能确定是否为Wolbachia或是其他的微生物，针对Wolbachia感染鉴定的特异性还欠缺，例如：16s(27F，1494R，1513R)。

因此，开发一种特异引物就显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有Wolbachia检测引物和方法存在假阴性、非特异性的缺陷和不足，利用NCBI网上的现有的Wolbachia16S基因序列重新设计并通过大量筛选后，获得更灵敏、更精确的16S特异引物，以便能够进行Wolbachia的鉴定。

本发明的第一个目的是提供一种检测鉴定昆虫体内Wolbachia感染的特异性扩增引物Tw16s1。

本发明的第二个目的是提供一种检测鉴定昆虫体内Wolbachia感染的方法。