[发明专利]一种利用叶绿体全基因组精准鉴别铁皮石斛及其近缘极易混淆种的方法

权利要求书

1.一种基于叶绿体全基因组序列对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行种质鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤 ：

（1）DNA提取和测序

分别取待检材料的叶片或茎尖及表皮，充分研磨，提取总DNA；将各个DNA样品分别进行高通量测序获取片段序列；步骤（1）所述的提取总DNA的方法为通过改良CTAB法提取总DNA；

（2）叶绿体基因组拼接

将上述片段序列进行修整，以有参方法进行拼接，将修整过的片段序列匹配到参考基因组上，提取合议序列从而获得待检样品全叶绿体基因组序列；

（3）叶绿体全基因组序列比对和构树

将上述拼接获得的待检样品叶绿体基因组序列以及标准参照序列和用作外类群的叶绿体基因组序列，进行多序列比对，然后去除空缺和比对模糊区域序列构树；其中使用MAFFT v7 .221软件进行多序列比对，然后去除空缺gap和比对模糊区域，去除方法为：利用GBLOCKS v .0 .91b软件，将参数allowed gap positions设为none，其余参数设为默认值，利用上述比对和校对完成的序列构建最大似然树；

（4）结果判定

构树完成后打开树文件，各待检样品分别与各自的标准参照序列聚为一支，且支持率大于85%，铁皮石斛及其近缘极易混淆种均得以成功鉴定；

步骤（1）所述改良CTAB法为：将研磨充分的样品，迅速转入离心管中，加入事先预热的CTAB抽提液：100 mmol/L Tris-HCl, 30mL/L EDTA, 1400 mmol/L NaCl, 2 % CTAB, 2 %PVP, 140 mmol/L β-巯基乙醇，65℃水浴1 h，每隔10 min轻轻震荡几次，加入氯仿异/戊醇，轻摇，使材料和试剂充分混匀；配平后离心，取上清液至新管，重复氯仿/异戊醇抽提步骤两次；加入2倍体积、预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置离心；70 %乙醇洗，自然风干；灭菌超纯水溶解保存；

步骤（3）和（4）所述标准参照序列包括铁皮石斛、黄石斛、始兴石斛、曲茎石斛、滇桂石斛和钩状石斛的叶绿体基因组。

2.根据权利要求1所述的种质鉴定的方法，其特征在于，步骤（1）所述将各个DNA样品分别进行测序获取5.0–8.0 Gb 数据量的片段序列。

3.根据权利要求1所述的种质鉴定的方法，其特征在于，步骤（2）所述将修整过的片段序列匹配到参考基因组上时，测序深度大于100×的DNA区域提取合议序列，测序深度小于100×的区域通过PCR扩增和测序补全。

4.根据权利要求1所述的种质鉴定的方法，其特征在于，步骤（2）所述拼接时所有待检样品以铁皮石斛叶绿体基因组，GenBank登录号LC348520， 为参考基因组。

5.根据权利要求1所述的种质鉴定的方法，其特征在于，步骤（3）所述的用于比对和构树的序列为各样品的叶绿体全基因组序列。

6.根据权利要求1所述的种质鉴定的方法，其特征在于，步骤（3）和（4）所述的标准参照序列为LC348520铁皮石斛、LC348720黄石斛、LC348860始兴石斛、LC348855曲茎石斛、LC348864滇桂石斛和LC348858钩状石斛，共6个。

7.根据权利要求1-6任一所述的种质鉴定的方法，其特征在于，步骤（3）和（4）所述基因组通过每个种从其代表性产区采集一株性状优良的野生植株，经开花鉴定无误后，测序获得其叶绿体基因组序列。