[发明专利]一种利用叶绿体全基因组精准鉴别铁皮石斛及其近缘极易混淆种的方法

说明书

本发明公开了一种利用叶绿体全基因组序列精准鉴别铁皮石斛及其近缘极易混淆种的方法，该方法包括以下步骤：DNA提取和测序；叶绿体基因组拼接；叶绿体全基因组序列比对和构树；结果判定。本发明的方法针对利用常规方法难以鉴别铁皮石斛及其近缘极易混淆种的问题，建立了一种基于叶绿体全基因组序列的种质鉴定方法，该方法也可为确立铁皮石斛及其近缘种的系统分类地位、追溯物种起源和进化历程提供数据支持和理论依据。利用此方法可对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行高效、精准地鉴别，同时此方法具有稳定性好、通用性强、可重复性好等特点。

技术领域

本发明属于铁皮石斛鉴定。具体涉及一种利用叶绿体全基因组序列对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行精准种质鉴定的方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)隶属于兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)，是我国特有珍稀濒危植物，主要分布于云南、贵州、广西、福建和浙江等地。铁皮石斛具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳、抗癌防老等功效，在《神农本草经》和《本草纲目》中均有记载，现已被列入中国药典。铁皮石斛由于其功效显著，价格昂贵，常常被其他价格低廉的石斛“冒充”，而这种混伪现象严重影响了该药材的有效性和安全性。目前市场上可用作混伪品的石斛种类较多且形态相似，往往难以区分；尤其是其近缘极易混淆种(黄石斛D.tosaense Makino，始兴石斛D.shixingense Z.L.Chen,S.J.Zeng etJ.Duan，曲茎石斛D.flexicaule Z.H.Tsi,S.C.Sun et L.G.Xu，滇桂石斛D.scoriarumW.W.Smith，钩状石斛D.aduncum Lindl.)，由于与铁皮石斛的亲缘关系极近，形态和遗传背景均高度相似，更是难以区别。

传统的石斛鉴别方法主要有外部形态观察和组织切片观察等，但易受个体差异和鉴别者经验等因素影响，往往准确性较差，尤其是在非花期(石斛属植物花期很短)，很难鉴定到种。近年来也使用一些分子标记或构建指纹图谱等，但此类方法操作较复杂，且易受产地、生长期等影响，稳定性较差。此外，药学工作者也尝试使用一些DNA片段序列鉴别石斛，虽然这一方法在大多数石斛中适用，但仍无法区分铁皮石斛及其近缘极易混淆种。因此，建立一种高效、精准鉴别铁皮石斛及其近缘极易混淆种的方法已是迫在眉睫。

叶绿体是植物特有的进行光合作用的细胞器，具有自身独立的基因组。叶绿体基因组具有基因组小、结构稳定、编码区较密集、基因种类和数量较稳定等特点，因此易于测序、组装和比对。近年来随着第二代测序技术的迅猛发展，测序成本不断降低，利用叶绿体全基因组进行物种鉴别已变得切实可行。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于叶绿体全基因组序列对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行种质鉴定的方法，该方法针对利用常规方法难以鉴别铁皮石斛及其近缘极易混淆种的问题，建立了一种基于叶绿体全基因组序列的种质鉴定方法，该方法也可为确立铁皮石斛及其近缘种的系统分类地位、追溯物种起源和进化历程提供数据支持和理论依据。

本发明还提供一种基于叶绿体全基因组序列对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行种质鉴定的方法的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种基于叶绿体全基因组序列对铁皮石斛及其近缘极易混淆种进行种质鉴定的方法，包括如下步骤：

(1)DNA提取和测序

分别取待检材料的叶片或茎尖及表皮，充分研磨，提取总DNA；将各个DNA样品进行高通量测序获取一定读长的片段序列(pair-end reads)；

(2)叶绿体基因组拼接

将上述片段序列进行修整(trim)后，以有参方法进行拼接，即：将修整过的片段序列匹配(map)到参考基因组上，提取合议序列(consensus)从而获得待检样品全叶绿体基因组序列；