[发明专利]一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法和试剂盒

权利要求书

1.一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

(1)提取HCC患者外周血单个核细胞的总RNA，进行反转录PCR，获得cDNA；

(2)以cDNA为模板分别扩增抗体基因V_H、kappa链和lambda链；得到第一扩增产物；

其中，扩增V_H的上游引物为：

第一V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：5’-CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCTGG-3’；

第二V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:2所示，具体为：5’-CAG GTC AAC TTA AGG GAG TCTGG-3’；

第三V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:3所示，具体为：5’-GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCTGG-3’；

第四V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:4所示，具体为：5’-CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCGGG-3’；

第五V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:5所示，具体为：5’-GAG GTG CAG CTG TTG CAG TCTGC-3’；

第六V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:6所示，具体为：5’-CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCAGG-3’；

扩增V_H的下游引物为：

第一V_H下游引物，序列如SEQ ID NO:7所示，具体为：5’-CGCCTCCACC TGA GGA GAC GGTGAC CAG GGT GCC-3’；

第二V_H下游引物，序列如SEQ ID NO:8所示，具体为：5’-CGCCTCCACC TGA AGA GAC GGTGAC CAT TGT CCC-3’；

第三V_H下游引物，序列如SEQ ID NO:9所示，具体为：5’-CGCCTCCACC TGA GGA GAC GGTGAC CAG GGT TCC-3’；

第四V_H下游引物，序列如SEQ ID NO:10所示，具体为：5’-CGCCTCCACC TGA GGA GAC GGTGAC CGT GGT CCC-3’；

扩增kappa链的上游引物为：

第一kappa链上游引物，序列如SEQ ID NO:11所示，具体为：5’-TGGCGGATCG GAC ATCCAG ATG ACC CAG TCT CC-3’；

第二kappa链上游引物，序列如SEQ ID NO:12所示，具体为：5’-TGGCGGATCG GAT GTTGTG ATG ACT CAG TCT CC-3’；

第三kappa链上游引物，序列如SEQ ID NO:13所示，具体为：5’-TGGCGGATCG GAA ATTGTG TTG ACG CAG TCT CC-3’；

第四kappa链上游引物，序列如SEQ ID NO:14所示，具体为：5’-TGGCGGATCG GAC ATCGTG ATG ACC CAG TCT CC-3’；

第五kappa链上游引物，序列如SEQ ID NO:15所示，具体为：5’-TGGCGGATCG GAA ACGACA CTC ACG CAG TCT CC-3’；

第六kappa链上游引物，序列如SEQ ID NO:16所示，具体为：5’-TGGCGGATCG GAA ATTGTG CTG ACT CAG TCT CC-3’；

扩增kappa链的下游引物为：

第一kappa链下游引物，序列如SEQ ID NO:17所示，具体为：5’-ACG TTT GAT TTC CACCTT GGT CCC-3；

第二kappa链下游引物，序列如SEQ ID NO:18所示，具体为：5’-ACG TTT GAT CTC CAGCTT GGT CCC-3’；

第三kappa链下游引物，序列如SEQ ID NO:19所示，具体为：5’-ACG TTT GAT ATC CACTTT GGT CCC-3’；

第四kappa链下游引物，序列如SEQ ID NO:20所示，具体为：5’-ACG TTT GAT CTC CACCTT GGT CCC-3’；

第五kappa链下游引物，序列如SEQ ID NO:21所示，具体为：5’-ACG TTT AAT CTC CAGTCG TGT CCC-3’；

扩增lambda链的上游引物为：

第一lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:22所示，具体为：5’-TGGCGGATCG CAG TCTGTG TTG ACG CAG CCG CC-3’；

第二lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:23所示，具体为：5’-TGGCGGATCG CAG TCTGCC CTG ACT CAG CCT GC-3’；

第三lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:24所示，具体为：5’-TGGCGGATCG TCC TATGTG CTG ACT CAG CCA CC-3’；

第四lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:25所示，具体为：5’-TGGCGGATCG TCT TCTGAG CTG ACT CAG GAC CC-3’；

第五lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:26所示，具体为：5’-TGGCGGATCG CAG CCTGTG CTG ACT CAR YC-3’；

第六lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:27所示，具体为：5’-TGGCGGATCG CAG GCTGTG CTC ACT CAG CCG TC-3’；

第七lambda链上游引物，序列如SEQ ID NO:28所示，具体为：5’-TGGCGGATCG AAT TTTATG CTG ACT CAG CCC CA-3’；

扩增lambda链的下游引物为：

第一lambda链下游引物，序列如SEQ ID NO:29所示，具体为：5’-ACC TAG GAC GGT GACCTT GGT CCC-3’；

第二lambda链下游引物，序列如SEQ ID NO:30所示，具体为：5’-ACC TAG GAC GGT CAGCTT GGT CCC-3’；

第三lambda链下游引物，序列如SEQ ID NO:31所示，具体为：5’-GAG GAC GGT CAG CTGGGT GC-3’；

(3)以步骤(2)的第一扩增产物为模板；使用Linker-r和Linker-s以及带有限制性酶切位点的V_H上游引物、所述扩增V_H的下游引物再次扩增V_H；使用Linker-r和Linker-s以及所述扩增kappa链的上游引物、带有限制性酶切位点的kappa链下游引物再次扩增kappa链；使用Linker-r和Linker-s以及所述扩增lambda链的上游引物、带有限制性酶切位点的lambda链下游引物再次扩增lambda链；得到第二扩增产物；

使用带有限制性酶切位点的连接引物将第二扩增产物中的V_H、kappa链和lambda链拼接成scFv基因库；

scFv其中，带有限制性酶切位点的V_H上游引物Linker引物为：

第一带有限制性酶切位点的V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:32所示，具体为：5’-GTCCTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GG-3’；

第二带有限制性酶切位点的V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:33所示，具体为：5’-GTCCTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTC AAC TTA AGG GAG TCT GG-3’；

第三带有限制性酶切位点的V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:34所示，具体为：5’-GTCCTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GG-3’；

第四带有限制性酶切位点的V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:35所示，具体为：5’-GTCCTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTG CAG CTG CAG GAG TCG GG-3’；

第五带有限制性酶切位点的V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:36所示，具体为：5’-GTCCTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC GAG GTG CAG CTG TTG CAG TCT GC-3’；

第六带有限制性酶切位点的V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:37所示，具体为：5’-GTCCTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG-3’；

Linker-r序列如SEQ ID NO:38所示，具体为：5’-CGA TCC GCC ACC GCC AGA ACC ACCTCC GCC TGA ACC GCC TCC ACC-3’；

所述带有限制性酶切位点的kappa链下游引物为：

第一带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQ ID NO:39所示，具体为：5’-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT TTC CAC CTT GGT CCC-3’；

第二带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQ ID NO:40所示，具体为：5’-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAG CTT GGT CCC-3’；

第三带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQ ID NO:41所示，具体为：5’-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT ATC CAC TTT GGT CCC-3’；

第四带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQ ID NO:42所示，具体为：5’-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT GAT CTC CAC CTT GGT CCC-3’；

第五带有限制性酶切位点的kappa链下游引物序列如SEQ ID NO:43所示，具体为：5’-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACG TTT AAT CTC CAG TCG TGT CCC-3’；

Linker-s的序列如SEQ ID NO:44所示，具体为：5’-GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGAGGT GGT TCT GGC GGT GGC GGA TCG-3’；

带有限制性酶切位点的lambda链下游引物为：

第一带有限制性酶切位点的lambda链下游引物序列如SEQ ID NO:45所示，具体为：5’-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT GAC CTT GGT CCC-3’；

第二带有限制性酶切位点的lambda链下游引物序列如SEQ ID NO:46所示，具体为：5’-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC ACC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCC-3’；

第三带有限制性酶切位点的lambda链下游引物序列如SEQ ID NO:47所示，具体为：5’-GAG TCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC GAG GAC GGT CAG CTG GGT GC-3’；

带有限制性酶切位点的连接引物的上游引物序列如SEQ ID NO:48所示，具体为：

5’-GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCG GCC ATG GCC-3’；

带有限制性酶切位点的连接引物的下游引物序列如SEQ ID NO:49所示，具体为5’-GAGTCA TTC TCG ACT TGC GGC CGC-3’。

(4)使用限制性内切酶Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切scFv基因库和使用所述限制性内切酶酶切噬粒载体，连接酶切后的scFv基因库和酶切后的噬粒载体；

(5)将步骤(4)的连接产物电转化宿主细胞，得到scFv基因库；

(6)培养转入了连接产物的宿主细胞，并得到scFv噬菌体抗体库；

(7)靶标噬菌体抗体的筛选和富集。