[发明专利]一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：(1)提取HCC患者外周血单个核细胞的总RNA，进行反转录PCR，获得cDNA；(2)以cDNA为模板分别扩增抗体基因V_H、kappa链和lambda链；得到第一扩增产物；以步骤(2)的第一扩增产物为模板；使用Linker‑r和Linker‑s以及带有限制性酶切位点的V_H上游引物、所述扩增V_H的下游引物再次扩增V_H；使用Linker‑r和Linker‑s以及所述扩增kappa链的上游引物、带有限制性酶切位点的kappa链下游引物再次扩增kappa链；使用Linker‑r和Linker‑s以及所述扩增lambda链的上游引物、带有限制性酶切位点的lambda链下游引物再次扩增lambda链；得到第二扩增产物；使用带有限制性酶切位点的连接引物将第二扩增产物中的V_H、kappa链和lambda链拼接成scFv基因库。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种HCC患者的全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法和试剂盒在生物治疗和检测方面的应用。

背景技术

肝细胞癌(HCC)占原发性肝癌的90％，是中国最常见的且具有破坏性的恶性肿瘤之一，是世界各地癌症死亡的第三位主要原因，其部分致病原因包括高突变率、eVective免疫逃避、抗原性差和血液供应充足。近期，尽管在HCC的诊断和治疗中取得重大进展，几十年来，其五年存活率一直保持在10％左右，在中国，HCC患者特别是晚期患者的治疗选择是有限的，每年大约有12万人死于HCC，在全球，HCC的致死率大约为44％。治疗HCC的传统方法主要包括手术、冷冻手术、经皮乙醇注射、射频热消融、动脉栓塞、化疗栓赛和全身化疗，然而这些疗法对于不可切除的HCC患者，均没有显著疗效，无法改善患者预后。因此，开发新的治疗策略包括免疫疗法等辅助治疗方法具有深远的临床应用意义。

抗体库技术是90年代抗体工程领域的重大进展，它是噬菌体展示和抗体库两种技术的集成，它的出现有赖于PCR技术的建立、抗体分子在大肠杆菌的功能性表达以及噬菌体展示技术的发展。噬菌体抗体库技术的原理就是将抗体分子的Fab或scFv等片段与单链噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白，展示于噬菌体颗粒表面。噬菌体抗体库技术模拟了抗体免疫系统的选择作用，呈现在噬菌体表面的抗体能够在体外与固相化的靶抗原相互作用，然后反复洗涤去除非特异性结合抗体，再洗脱并收集与抗原结合的噬菌体，再次感染大肠杆菌，使特异的噬菌体得到富集。

现有技术中构建的scFv噬菌体抗体库库容不高，并且多样性也较低。HCC患者来源的全人源化scFv噬菌体库是由V_H和V_L组成，并由一个编码小肽(Gly4Ser)3的DNA Linker连接成的抗体库，为制备高亲和性的人源抗体提供了有力的工具，该技术无需免疫即可制备全人源性抗体，可有效避HAMA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法和试剂盒，用以解决现有技术中的问题。

为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种全人源化scFv噬菌体抗体库的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

(1)提取外周血单个核细胞的总RNA，进行反转录PCR，获得cDNA；

(2)以cDNA为模板分别扩增抗体基因V_H、kappa链和lambda链；得到第一扩增产物；

其中，扩增V_H的上游引物为：

第一V_H上游引物，序列如SEQ ID NO:1所示，具体为：5’-CAG GTG CAG CTG GTGCAG TCT GG-3’；