[发明专利]一种表达酰基辅酶A-还原酶的基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种表达酰基辅酶A‑还原酶的基因工程菌及其应用。所述的基因工程菌为在新金色分枝杆菌(Mycobacterium.neoaurum)中整合有至少由强启动子pG13启动表达的酰基辅酶A‑还原酶基因phsR的基因工程菌。本发明还公开了一种表达载体，其依次含有强启动子pG13和酰基辅酶A‑还原酶基因phsR；以及所述的表达载体在制备上述的基因工程菌中的应用；本发明还公开了一种甾体化合物4‑BNA的制备方法。上述基因工程菌可高效专一的产生4‑BNA，摇瓶中甾醇降解产物中4‑BNA的产率高达90％以上，5L发酵罐中甾醇降解产物中4‑BNA的产率高达97％以上。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达酰基辅酶A-还原酶的基因工程菌及其应用。

背景技术

甾体化合物又称类固醇，此类化合物虽然种类繁多，但都是以环戊烷多氢菲为母核辅以不同的侧链和取代基所构成的，在临床上占有及其重要的地位。其核心结构详见图6，即：由三个环己烷并上一个环戊烷，甾体化合物则是在A、B、C和D环的不同位置连接上不同的取代基，如10和13位常见的是甲基，17位会有长短不同的烷烃侧链，3位常见为羟基和羰基，而在环的不同位置也经常会出现双键官能团(图6)。也正因为环上不同位置取代基的多样性，便组成了一系列生物活性多样的化合物。截止到2012年，全球药物市场中甾体类药物年销售额高达数百亿美元，在全球医药产品总量中的占比高达约10％，并且近几年来还呈现明显的上升趋势(Appl Microbiol Biotechnol,2012,94,1423-1447)。而在临床上根据其功能，甾体药物主要可以分为皮质激素、性激素和蛋白同化激素。其中，黄体酮就是十分典型的代表。黄体酮(progesterone)又称孕酮激素、黄体激素，是由卵巢分泌的生物活性物质。临床上，黄体酮给女性子宫内膜提供保护，在胎儿的前期发育中起着重要作用，并且黄体酮和雌性激素协同作用共同促进着女性第二性征的成熟发育。目前，通过化学方法合成黄体酮由于合成步骤繁多，产量低，污染大等诸多弊端，因此通过生物方法合成黄体酮也就迫在眉睫。

已有文献(CN106589037A、CN107129516A)报道，植物甾醇的降解中间产物4-BNA可以通过几步简单成熟的化学反应就能够得到黄体酮，因此，通过微生物降解甾醇制得4-BNA就成了关键点。然而，鉴于现有技术中4-BNA难以获得，利用4-BNA进行黄体酮的化学合成一直没有得到很好的发展。

现有技术中有关于细菌通过降解甾醇获得4-BNA的记载，例如新金色分枝杆菌、诺卡氏菌和红球菌等。尽管降解甾醇的菌属不少，然而其降解机制却高度保守(见图1)。这些菌属通过降解甾醇得到主要产物是雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)、雄甾-1,4-烯-3,17-二酮(ADD)、9a-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-OH-AD)等中间体，反而降解甾醇得到的4-BNA都只是作为其中的一个副产物，产量极低(目前文献报道最高的产率为15％左右)；且4-AD、ADD、9-OH-AD等中间体可应用于甾体类药物的制备，故现有技术中的研究将更多的精力集中于高4-AD、ADD以及9-OH-AD等主产物的制备(CN106434705A)。即便4-BNA具有较高的产量，但由于其与4-AD等中间体的化学性质非常相近，难以与AD分离，极大地增加了获得高产量高纯度的4-BNA的难度。因此，高产量专一地制备4-BNA将对甾体类药物的工业生产产生极为重要的意义，但遗憾的是至今却仍未见相关的技术报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中用于合成甾体化合物黄体酮的化学合成方法存在方法繁琐、合成效率低等诸多弊端，且用于合成黄体酮的中间体难于获得等缺陷而提供一种表达酰基辅酶A-还原酶的基因工程菌及其应用。该基因工程菌可高效专一的产生4-BNA，能够消除4-AD、ADD、9OH-AD等其他代谢中间体，摇瓶中甾醇降解产物中4-BNA的产率高达90％以上，5L发酵罐中甾醇降解产物中4-BNA的产率高达97％以上。

本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题：