[发明专利]一种利用人诱导多能干细胞获得富含视锥及视杆细胞的类视网膜组织的方法

权利要求书

1.一种利用人诱导多能干细胞获得富含视锥及视杆细胞的类视网膜组织的方法，其特征在于，包括将细胞系UE017消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀悬浮于Blebbistatin培养液中，拟胚体制备当天标记为第0天，次日记为第1天，第1天，培养液替换为体积分数25% NIM+体积分数75% mTeSR1；第2天，培养液替换为体积分数50% NIM+体积分数50% mTeSR1，从第三天开始全部换成NIM培养液培养，连续悬浮培养至第6-7天，得到拟胚体，拟胚体再接种至预先用Matrigel包被的培养皿中，在第6-15天用NIM培养液贴壁诱导培养，第16-41天用RDM培养液进行培养获得3D类视网膜，3D类视网膜包括NR组织和RPE，第42-90天，3D类视网膜用加入了FBS的RC2培养液进行培养，第91天后用RC1培养液进行培养，NR发育出所有视网膜细胞，包括高度成熟的光感受器细胞，Rhodopsin阳性视杆细胞和L/M OPSIN阳性红绿视锥细胞和S-OPSIN阳性蓝视锥细胞，尤其获得富含红绿视锥细胞和视杆细胞的视网膜组织；

所述的NIM培养液，包括500ml 1:1 DMEM/F12、5ml 100× N2、0.5ml 含2mg/mlHeparin的PBS溶液、5ml 100× MEM-NEAA；

所述的RDM培养液，包括300ml 1:1 DMEM/F12、200ml DMEM basic、10ml 50× B27without vitamin A、5ml 100× antibiotic and antimycotic、5ml 100× MEM-NEAA；

所述的RC2培养液，包括250ml 1:1 DMEM/F12、175ml DMEM basic、10ml 50× B27without vitamin A、5ml 100× antibiotic and antimycotic、5ml 100× MEM-NEAA、50ml FBS、5ml 100× GlutaMax、0.5ml 1000× Taurine；

所述的RC1培养液，包括450ml 1:1 DMEM/F12-Glutamax、5ml 100× N2 supplement、5ml 100× antibiotic and antimycotic、5ml 100× MEM-NEAA、50ml FBS、0.5ml 1000×Taurine。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的将细胞系UE017消化得到细胞沉淀是将细胞系UE017用EDTA消化得到细胞沉淀。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的用EDTA消化是用0.5μM EDTA，37℃消化5min。

4.一种高效简单的从hiPSCs诱导分化出富含大量视锥细胞和视杆细胞的3D视网膜的方法，其包括获得3D视网膜组织，然后将3D视网膜组织在培养液中进行培养，其特征在于，是在第1-48天，3D类视网膜用加入了FBS的RC2培养液进行培养，第49天后用RC1培养液进行培养；

所述的RC2培养液，包括250ml 1:1 DMEM/F12、175ml DMEM basic、10ml 50× B27without vitamin A、5ml 100× antibiotic and antimycotic、5ml 100× MEM-NEAA、50ml FBS、5ml 100× GlutaMax、0.5ml 1000× Taurine；

所述的RC1培养液，包括450ml 1:1 DMEM/F12-Glutamax、5ml 100× N2 supplement、5ml 100× antibiotic and antimycotic、5ml 100× MEM-NEAA、50ml FBS、0.5ml 1000×Taurine。