[发明专利]一种利用人诱导多能干细胞获得富含视锥及视杆细胞的类视网膜组织的方法

说明书

本发明公开了一种利用人诱导多能干细胞获得富含视锥及视杆细胞的类视网膜组织的方法。它包括将hiPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀悬浮培养得到拟胚体；拟胚体再接种至预先用Matrigel包被的培养皿中，在诱导培养液中诱导分化，获得神经视网膜(NR)和RPE；将NR和RPE再挑起，悬浮培养，获得3D类视网膜包括NR组织，随后在没有视黄酸的优化培养液中继续悬浮培养，NR分化出所有视网膜细胞，包括高度成熟的光感受器细胞，Rhodopsin阳性视杆细胞，L/M OPSIN阳性红绿锥细胞和S‑OPSIN阳性蓝锥细胞,尤其获得了富含红绿视锥及视杆细胞的类视网膜组织。

技术领域：

本发明属于干细胞再生生物领域，具体涉及多能干细胞再生类视网膜器官，获取视网 膜种子细胞的方法。

背景技术

视网膜退行性疾病是导致不可逆性失明的主要眼病，主要由于光感受器细胞、RPE细 胞或神经节细胞遭受不可逆损伤。然而，该类疾病目前尚无有效治疗方法。干细胞治疗为 该类疾病带来了新的复明希望，获得与人视网膜细胞特性类似的，且数量充足的种子细胞， 是视网膜退行性疾病复明治疗及疾病机制研究的关键。

人视网膜细胞以往多从流产的胚胎视网膜中分离获得，但数量非常有限，批次质量等 难以控制，无法满足临床治疗的需要,限制了视网膜细胞治疗技术的发展。近年来，人视网 膜细胞也可以从人多能干细胞(human pluripotent stem cell,hPSC)包括胚胎干细胞(ESC) 及诱导多能干细胞(iPSC)定向诱导分化而来，为视网膜种子细胞提供了新的来源。目前， 已有多种诱导分化方案指导hPSC逐步向视网膜细胞分化。第一，在经典贴壁(即二维， 2D)培养条件下，hPSC不仅分化出了多种视网膜细胞，包括神经节细胞，RPE细胞以及光 感受器细胞等，还可直接诱导出原始视泡样结构，后者进一步分化出多种视网膜细胞；第 二，随着3D悬浮组织诱导培养体系的发展，3D视网膜诱导培养方法诞生。日本科学家利用悬浮EBs的方法，分别从小鼠和人的ESC分化获得了3D视泡，后者进一步分化出各种 发育中的视网膜细胞；第三，我国科学家钟秀风教授采用2D与3D结合的诱导培养条件， 开发了一套视网膜诱导分化体系，先将hiPSCs悬浮培养，获得拟胚体EBs，再将EBs重新 贴壁分化，获得了具有分层结构的3D类视网膜组织，包括所有主要视网膜细胞，长期培养 后可以获得具有功能的光感受器细胞。

尽管多能干细胞诱导视网膜的技术取得长足进步，但目前视网膜诱导分化方案也存在 一些不足。第一，多数诱导方案较复杂，需要添加各种细胞因子或信号分子，包括视黄酸A (retinoic acid,RA)；第二，所获的视网膜光感受器细胞以视杆细胞为主，视锥细胞很少。 视锥细胞负责强光视觉或明视觉、色彩和精锐视觉，集中在视网膜的黄斑区域。视杆细胞 负责夜视觉或暗视觉，分布在视网膜的周边部。人类主要在白天活动，因此，主要依赖于视锥细胞的功能。年龄相关视网膜黄斑病变已成为全球50岁以上人群的主要致盲眼病，主要由视锥细胞变性死亡所致。因此，当前的视网膜诱导方案难以满足临床治疗所需。

发明内容：

针对现有视网膜诱导分化技术存在的问题(成分复杂，难以获得视网膜疾病治疗所需 要的视锥细胞)，本发明提供了一种改良的、简单、高效获取富含视杆及视锥细胞的类视网 膜的诱导方案。

本发明的利用人诱导多能干细胞获得富含视锥及视杆细胞的类视网膜组织的方法，包 括将hiPSCs克隆消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀悬浮培养得到拟胚体；拟胚体再接种至 预先用Matrigel包被的培养皿中，在诱导培养液中诱导分化，获得神经视网膜(neural retina, NR)和RPE；将NR和RPE再挑起，悬浮培养，获得3D类视网膜包括NR组织和RPE。 使用不含RA的培养液中长期悬浮培养，NR不仅可以发育出所有视网膜细胞，包括高度成 熟的光感受器细胞，Rhodopsin阳性视杆细胞，L/M OPSIN阳性红绿锥细胞和S-OPSIN阳性蓝锥细胞，特别是获得了富含视杆和红绿视锥细胞的NR或类视网膜组织。