[发明专利]基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物及其方法有效
| 申请号： | 201810510162.8 | 申请日： | 2018-05-24 |
| 公开（公告）号： | CN108486227B | 公开（公告）日： | 2022-01-04 |
| 发明（设计）人： | 龚世平;曹代男;魏玉峰;李伟业;段好冉;葛研 | 申请（专利权）人： | 广东省科学院动物研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851;C12N15/11 |
| 代理公司： | 广州科粤专利商标代理有限公司 44001 | 代理人： | 刘明星 |
| 地址： | 510260 广东*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基于 环境 dna 技术 红耳龟 生物量 评估 引物 及其 方法 | ||
1.一种基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的引物，其特征在于，所述的引物为：
上游引物F：5'-GGGATGACCAAATCTACAATG-3'；
下游引物R：5'-TAATGGCACGAGTCAGTTCC-3'。
2.一种基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取红耳龟的基因组DNA，获得DNA原液，然后将DNA原液进行梯度稀释，以稀释后的DNA作为反应模板，并利用权利要求1所述的引物进行qPCR扩增，制作红耳龟DNA浓度与qPCR反应Ct值的标准曲线；
(2)采集不同红耳龟群体密度环境下的水体，采用过滤法提取水体中的eDNA，以水体eDNA作为模板进行qPCR检测，记录Ct值；
(3)根据步骤(1)得到的红耳龟DNA浓度与qPCR反应Ct值的标准曲线，以及步骤(2)得到的Ct值，计算出红耳龟eDNA；并将红耳龟eDNA以及对应的红耳龟生物量制成相应曲线，据此判断红耳龟eDNA与红耳龟生物量的关系。
3.根据权利要求2所述的基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的方法，其特征在于，所述步骤(1)中DNA原液进行梯度稀释的倍数分别为8倍、16倍、32倍、64倍、128倍、256倍、512倍、1024倍和2048倍。
4.根据权利要求2所述的基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的方法，其特征在于，所述步骤(1)qPCR的反应体系为：红耳龟DNA模板DNA 2μL，2×SYBR qPCR Master Mix 10μL，100nmol/L的上游引物和100nmol/L的下游引物各0.5μL，ddH2O 7μL；反应条件为：95℃3min；95℃10s，57℃30s，72℃60s，40个循环；95℃15s，57℃60s，95℃15s；4℃保存。
5.根据权利要求2所述的基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的方法，其特征在于，所述步骤(2)过滤法滤膜的孔径为0.45μm。
6.根据权利要求2所述的基于环境DNA技术对红耳龟生物量评估的方法，其特征在于，所述步骤(2)qPCR的反应体系为：水体eDNA 2.0μL，2×SYBR qPCR Master Mix 10μL，100nmol/L的上游引物和100nmol/L的下游引物各0.5μL，ddH2O 7μL；反应条件为：95℃3min；95℃10s，57℃30s，72℃60s，40个循环；95℃15s，57℃60s，95℃15s；4℃保存。
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